本发明涉及体外核酸检测，具体涉及一种基于mb-rt-pcr检测高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒及检测方法。
背景技术：
1、猪繁殖与呼吸综合征（porcine reproductive and respiratory syndrome,prrs）是一种由猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratorysyndrome viruse，prrsv）引起的以母猪繁殖障碍、各种年龄猪特别是仔猪呼吸道疾病为主要特征的急性传染病，具有高发病率、高死亡率、低治愈率的特点，在全球主要养猪国家均有。目前，hp-prrsv检测方法主要有病毒分离、常规pcr、反转录一环介导等温扩增（rt-lamp）和荧光定量pt-pcr法等，例如在专利文件cn101343670a中公开了一种常规pcr检测方法试剂盒；在专利文件cn104745726a中采用三重实时荧光定量pcr技术，能够快速检测猪蓝耳病病毒、高致病性猪蓝耳病病毒和猪瘟病毒。这些方法操作复杂，所需时间长，而且对检测环境要求苛刻，无法进行病毒定量，无法确定疾病发生程度，而且这些hp-prrsv检测方法全都基于2006年发现的高致病性猪蓝耳病病毒株进行设计，而prrsv在不断的发生变异，某些变异会影响病毒生物学特性，新的变异型hp-prrsv传染性和毒性增强，以往的检测方法及试剂盒不能满足对近几年出现的hp-prrsv进行检测。虽然在专利文件cn105648114b中公开了一种检测国内2012年后新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的荧光rt-pcr引物、荧光探针以及其试剂盒的检测方法，但只针对于检测2012年~2020年之间的国内新变异型高致病性猪蓝耳病病毒，检测范围有限。
2、常见的病毒检测是rt-pcr技术，其标记方法一般为荧光染料嵌合法（sybr greeni）、荧光探针法（taqman探针）和分子信标法。其中分子信标(molecular beacon，mb)是一种有茎环结构的荧光探针，当没有靶序列存在时，分子信标探针低温时自身闭合，荧光基团和淬灭基团相互靠近而不发荧光，而在有靶序列存在的情况下，分子信标低温时与互补的靶序列形成稳定的双链杂交体，使荧光基团和淬灭基团分离，发出荧光，随着循环次数的增加，与模板结合的分子信标的量亦增加，最终的荧光强度与扩增的模板量成正比。该技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，还可以进行实时检测。因此，如果能利用分子信标探针在不同温度下发出荧光强度的差异的特点，设计出一种能检测高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒，以及使用该试剂盒的检测方法，不仅能解决现有技术敏感性不高、检测范围有限等缺点，还有利于新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的辅助诊断和流行病学研究。
技术实现思路
1、针对现有技术的缺陷，本发明设计了一种基于mb-rt-pcr方法能快速检测高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒，同时提供了使用该试剂盒的检测方法。所述试剂盒具有异性强、敏感性高、耗时短的特点。
2、为了实现上述目的，本发明解决技术问题采用如下技术方案：
3、本发明设计了一种基于mb-rt-pcr检测高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒，所述试剂盒包括mb-rt-pcr反应液、酶混合液、阴性质控品、阳性质控品，其中所述mb-rt-pcr反应液包括如seq id no.1所示的上游引物，如seq id no.2所示的下游引物，如seq id no.3所示的分子信标探针。
4、具体地，所述上游引物的序列为5 '-ggcaagcagcagaagagaa-3 '；所述下游引物的序列为5'-ttcccggtcccttgcctctg -3'；所述分子信标探针为mb探针，序列为：5'-cagcaa-gccagtcaatcagctgtgcca-ttgctg-3'。
5、上述引物和探针的衍生序列也为本发明的保护范围，所述衍生序列包括引物序列的互补链序列，或引物序列5’端和3’端方向延伸一至五个碱基或删减一至五个碱基得到的序列。
6、在其中一个实施例中，所述上游引物、下游引物与探针的体积比为（0.05~0.1）：（0.05~0.1）：（0.01:0.02）。
7、具体地，所述上游引物、下游引物与探针的体积比为0.35:0.35:0.01。
8、在其中一个实施例中，所述分子信标探针的3’端标记有荧光淬灭基团，5’端分别标记有荧光报告基团。
9、具体地，所述荧光报告基团选自fam、cy5、rox、vic、或texas red；所述荧光淬灭基团选自bhq-1、bhq-2、bhq-3、dabcyl、dabsyl、tamra或tamra。
10、在其中一个实施例中，所述mb-rt-pcr反应液还包括rt-pcr缓冲液、pcr增强剂、氯化镁、三磷酸脱氧核糖核苷酸混合物、含有镁离子的缓冲液。
11、在其中一个实施例中，所述rt-pcr缓冲液包括ph为7.5~8.9且浓度为20mm~80m的tris-hcl、10mm~5m硫酸铵、100mm~4m氯化钾和体积比为0.01~0.3%的triton x-100，具体地，tris-hcl的ph为8.0。
12、在其中一个实施例中，所述pcr增强剂选自四甲基氯化铵、肉碱、海藻糖和非离子去污剂np-40中的至少一种。
13、在其中一个实施例中，所述酶混合液含有taq dna聚合酶2u/μl~6u/μl、高热稳定性的逆转录酶5u/μl~12u/μl和rna酶抑制剂1u/μl~5u/μl。
14、具体地，所述酶混合液含有taq聚合酶5u/μl、高热稳定性的逆转录酶10u/μl和rna酶抑制剂2u/μl。
15、本发明还提供了一种检测高致病性猪蓝耳病病毒的mb-rt-pcr方法，所述方法具体步骤包括：
16、s1:提取样本总rna，并反转录合成单链cdna；
17、s2:将步骤s1合成的cdna作为模板，利用所述的检测高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒的引物对模板进行pcr扩增反应，反应结束后检测分析。
18、具体地，将cdna的循环阈值ct与标准曲线对照，得到cdna中高致病性猪蓝耳病病毒基因片段拷贝浓度。
19、在其中一个实施例中，所述步骤s2中采用25μl pcr扩增体系，包括14μlmb-rt-pcr反应液、1μl酶混合液、10μl模板。
20、在其中一个实施例中，所述pcr扩增反应条件为：50℃ 20min；95℃ 5min；95℃15s，53℃~60℃ 30s，40个循环。
21、具体地，pcr扩增反应条件为：50℃ 20min；95℃ 5min；95℃ 15s，57℃ 30s，40个循环。
22、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
23、本发明针对新变异型高致病性猪蓝耳病病毒orf7编码的核衣壳蛋白n基因设计了一组引物对和分子信标探针，该基因涵盖近几年国内外的变异株，国外包括2022年塞尔维亚分离株01-5573/d2022、2021年美国分离株usa/in105404/2021、2022年韩国分离株18r10-24-1、2022年韩国分离株20d160-1、2021年韩国分离株k07-2273等。同时，本发明设计了包含所述引物对和探针的能用于检测新变异型高致病性猪蓝耳病病毒的试剂盒以及检测方法。此外，本发明还优化了引物、探针浓度和pcr反应条件，不仅克服了传统试剂盒敏感性不高、检测结果可重复性差的缺陷，还能适用近年来的新变异株，检测范围广泛。