一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法-k8凯发

本发明属于植物基因工程，具体为一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法。

背景技术：

1、紫斑牡丹(paeonia rockii)是我国牡丹野生种之一，因其纯白色花瓣的基部有一个深紫色斑点而得名。作为牡丹野生种中最濒危的种类，紫斑牡丹是牡丹色斑品种的主要遗传来源，但其花瓣基部色斑形成的分子机制仍不清楚。紫斑牡丹从实生苗到开花需要经历3～4年的时间且实生苗性状变异较大。目前通过转基因技术在本源植物上来验证紫斑牡丹基因的功能，存在一定的技术瓶颈，紫斑牡丹再生及遗传转化较为困难，且尚无稳定转化体系。病毒诱导的基因沉默避免了植物转化的需要，方法简单，结果迅速。

2、病毒诱导的基因沉默(virus-induced gene silencing,vigs)是利用植物抗病毒防御机制作为植物反向遗传学工具的技术，将携带植物功能基因cdna的病毒侵染植物，引起基因沉默和表型变异，通过表型变异进行基因功能分析的方法。

3、vigs的作用机制是：病毒侵染植物细胞引起双链rna的积累，双链rna在植物体内被dicer酶降解成小分子干扰rna(sirna)，sirna与rnaase结合形成rna诱导的沉默复合体(rna-induced silencing complex,risc)，risc特异性地攻击同源mrna导致其降解，进而达到基因沉默的目的。

4、烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,trv)载体是vigs技术用于植物基因功能研究的优选载体，是从trv基因组发展的一种vigs载体，侵染效率和持久性较好，能够介导基因沉默的同时不会带来病毒诱导的症状，因而应用广泛。rna1和rna2 cdna的双元表达载体trv1和trv2是植物vigs常用沉默载体。trv2用于携带目的基因，trv1负责辅助病毒载体，增强侵染效率。

5、目前关于vigs技术在紫斑牡丹花瓣基部色斑形成过程中相关基因功能验证的报道还未发现。

技术实现思路

1、针对上述情况，为弥补上述现有缺陷，本发明提供了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，通过本方案中提供的方法可以高效地使trv病毒载体浸染发育中的紫斑牡丹花瓣色斑部位，并产生明显表型。

2、本发明提供如下的技术方案：本发明提出的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，具体包括下述步骤：

3、1)将trv1病毒载体、trv2空载体和携带目的基因的trv2重组载体分别转化农杆菌，对鉴定后的阳性农杆菌进行扩大培养，离心后用侵染缓冲液重悬，得混合菌液；

4、2)采用真空抽滤花瓣盘法或者花苞注射菌液法对紫斑牡丹花瓣或花苞进行侵染，并观察表型。

5、进一步地，步骤2)中采用真空抽滤花瓣盘法进行侵染的具体步骤为：

6、(1)用打孔器将花瓣色斑部位取下，置于混合菌液中；

7、(2)用真空泵抽真空至0.7atm，负压处理45min，辅助混合菌液侵染花瓣；

8、(3)真空抽滤侵染后的花瓣盘放入干净的培养皿中，喷施清水使花瓣盘保持湿润，置于阴凉处48h后观察表型，并保存样品用于hplc检测花色苷含量变化。

9、进一步地，所述花瓣色斑为初开期花瓣的色斑部位。

10、进一步地，步骤2)中采用花苞注射菌液法进行侵染的具体步骤为：

11、用无菌注射器吸取1ml混合菌液注射插入牡丹花苞，24h后补充注射一次，待注射过菌液的花苞开放后观察表型，进行花色值测定，并采样、提取rna进行实时荧光定量测定相关基因的表达量变化以及hplc测定花青苷的含量变化。

12、进一步地，所述紫斑牡丹花苞接种时的发育阶段处于风铃期，要求在花瓣色斑未形成时注射。

13、进一步地，所述紫斑牡丹花苞注射插入部位为花苞中部，斜向下插至萼片位置的中间部位。

14、进一步地，步骤1)中所述的农杆菌为gv3101农杆菌或者eha105农杆菌，转化农杆菌采用冻融法。

15、进一步地，步骤1)中所述侵染缓冲液包括以下组分：10mm mgcl2、10mm mes、5mm乙酰丁香酮。

16、进一步地，步骤1)中，将含有trv1、trv2或携带目的基因的trv2重组载体的阳性农杆菌扩大培养至od600值为0.8-1.2，离心收集菌体后用侵染缓冲液重悬至od600为1，并将trv2空载体和携带目的基因的trv2重组载体的重悬液分别与trv1病毒载体重悬液按1:1的比例混合，获得混合菌液。

17、优选地，农杆菌扩大培养至od600值为0.8，离心机5000rpm离心15min后将侵染缓冲液重悬至od600值为1。

18、采用上述结构本发明取得的有益效果如下：本发明提出的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，具有下述优点：

19、(1)采用真空抽滤花瓣盘的方法，采样后可在实验室进行，方便观察。

20、(2)采用花苞注射菌液的方法，利用带针头的注射器将菌液侵染入花苞，无需稳定转化和无菌操作即可验证目的基因在花瓣基部花青苷合成中的作用。

21、本方案中提供的上述两种方法均可以高效地使trv病毒载体浸染发育中的紫斑牡丹花瓣基部，并产生明显表型。本发明为病毒诱导基因沉默技术在紫斑牡丹花瓣基部色斑形成过程中花青苷相关基因的功能研究提供了两种快捷高效的验证方法。对研究紫斑牡丹花瓣色斑形成机理提供了新的思路。

技术特征：

1.一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，具体包括下述步骤：

2.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤2)中采用真空抽滤花瓣盘法进行侵染的具体步骤为：

3.根据权利要求2所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，所述花瓣色斑为初开期花瓣的色斑部位。

4.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤2)中采用花苞注射菌液法进行侵染的具体步骤为：

5.根据权利要求4所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，所述紫斑牡丹花苞接种时的发育阶段处于风铃期，要求在花瓣色斑未形成时注射。

6.根据权利要求5所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，所述紫斑牡丹花苞注射插入部位为花苞中部，斜向下插至萼片位置的中间部位。

7.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤1)中所述的农杆菌为gv3101农杆菌或者eha105农杆菌，转化农杆菌采用冻融法。

8.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤1)中所述侵染缓冲液包括以下组分：10mm mgcl2、10mm mes、5mm乙酰丁香酮。

9.根据权利要求1所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，步骤1)中，将含有trv1、trv2或携带目的基因的trv2重组载体的阳性农杆菌扩大培养至od600值为0.8-1.2，离心收集菌体后用侵染缓冲液重悬至od600为1，并将trv2空载体和携带目的基因的trv2重组载体的重悬液分别与trv1病毒载体重悬液按1:1的比例混合，获得混合菌液。

10.根据权利要求9所述的一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，其特征在于，农杆菌扩大培养至od600值为0.8，离心机5000rpm离心15min后将侵染缓冲液重悬至od600值为1。

技术总结
本发明公开了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法。本发明属于植物基因工程技术领域，具体提供了一种紫斑牡丹花瓣基部色斑形成基因沉默方法，在本方案中通过将目的基因构建至trv2载体，重组载体转化农杆菌后，对包含目的基因的农杆菌扩大培养，离心后将菌体重悬，分别以真空抽滤花瓣盘和花苞注射菌液的方法侵染花瓣色斑或花苞。经过两种方法侵染过的紫斑牡丹花瓣色斑可以观察到明显的表型效果，经hplc检测可发现花色苷含量的显著下降。对花苞注射菌液后的花瓣材料进行结构基因的实时荧光定量检测实时荧光定量，发现目的基因的表达被有效抑制。本发明为紫斑牡丹花瓣基部色斑形成相关基因的功能研究提供一种效果显著、高效快捷的侵染方法。

技术研发人员：史倩倩,王舒,唐天琪
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8