一种非酒精性脂肪肝炎动物模型诱导用纯化饲料及其应用的制作方法-k8凯发

本发明涉及动物模型饲料及动物模型构建，尤其涉及一种非酒精性脂肪肝炎动物模型诱导用纯化饲料及其应用。

背景技术：

1、非酒精性脂肪肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，nash)是一类具有炎症细胞浸润和坏死的严重肝病，是非酒精性脂肪肝病向更严重肝病发展的一个重要的过渡阶段，其特征在于肝细胞气球样变和炎症，并且可以发展为纤维化、肝硬化、肝细胞癌和肝衰竭。目前，针对nash适应症的大多数药物还处在开发阶段，究其原因除发病机制不清，病因复杂外，理想化实验模型的缺乏也是其中的原因之一。现有的实验性模型大多都不能够很好地模拟人类nash疾病的发生、发展以及严重程度，大多数模型不形成脂肪肝炎，严格意义上存在肝细胞气球样病变却不存在mallory小体和伴随炎症的大泡性脂肪变性。因此，建立一种具有与人类病理特征相似、死亡率低、模型重复率好、造模时间短、造模成本低等优点的非酒精性脂肪肝炎的动物模型迫在眉睫。

2、饮食因素在非酒精性脂肪肝炎膳食动物模型中起着至关重要的作用，这些模型主要利用蛋氨酸和胆碱缺乏、高脂、高糖、高胆固醇、胆酸盐、果糖、高碳水化合物等多种饮食因素来制备。(1)蛋氨酸胆碱缺乏饮食模型的优势在于较好地复制了人类严重非酒精性脂肪肝炎的病理表现，其炎症、纤维化和肝细胞凋亡发展得快且严重，内质网应激和氧化应激也活跃，因此，常用于非酒精性脂肪肝炎的组织学进展及其炎症和纤维化机制研究；然而，蛋氨酸胆碱缺乏饮食模型不肥胖，反而体重减轻，且无胰岛素抵抗，血清胰岛素、空腹血糖、瘦素和甘油三酯等水平降低，与人类非酒精性脂肪肝炎的代谢状况存在差异。(2)高脂饮食模型表现出类似于人类非酒精性脂肪肝炎的生化改变，在组织病理学上也出现了炎症，但缺乏进行性纤维化；相比于蛋氨酸胆碱缺乏饮食模型，高脂饮食模型的肝病变程度与并不严重，并且它的造模时间也相对较长；此外，高脂饮食所致nash的动物模型虽多有报道，但造模周期平均为3～5个月，甚至长达1年，无法满足药物高通量和快速筛选的需求。

3、因此，在不严重影响营养平衡的前提下，适当增加其他饮食因素，以寻求一种通过优化饲料成分来放大非酒精性脂肪肝炎病症的严重程度以及触发纤维化效应的方法，从而构建一种更加优化、时间更短、成功率更高，且在各方面更接近于人的非酒精性脂肪肝炎发生发展过程的动物模型。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在的不足，为了克服现有技术中存在的至少一个问题，例如非酒精性脂肪肝炎造模饲料的诸多弊端，包括动物体重不断下降、实验周期长等技术问题，本发明提供一种非酒精性脂肪肝炎动物模型诱导用纯化饲料，利用上述纯化饲料饲喂小鼠6周后，小鼠体重逐渐增加，血清甘油三酯(tg)、谷氨酸氨基转移酶(alt)、天冬氨酸氨基转移酶(ast)和低密度脂蛋白(vdl)显著升高，高密度脂蛋白(hdl)显著降低，小鼠肝脏内出现明显的脂肪病变性和炎性病灶，为人类非酒精性脂肪肝炎的研究提供了更为便利的前提实验条件。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、本发明的第一个方面是提供一种非酒精性脂肪肝炎动物模型诱导用纯化饲料，以占饲料总质量的重量百分比计，所述纯化饲料包括氨基酸混合物15～35％、玉米淀粉5～10％、麦芽糊精5～10％、蔗糖5～10％、纤维素5～10％、大豆油3～5％、猪油30～35％、碳酸氢钠0.5～2％、矿物质混合物5～10％、维生素混合物0.05～0.2％；其中，所述氨基酸混合物中含有微量的蛋氨酸，不含胆碱，所述蛋氨酸含量为纯化饲料总质量的0.1～0.2％。为了提高饲料的造模效果，将饲料中的胆碱完全去除，保留微量蛋氨酸，并提高脂肪含量。

4、进一步地，所述纯化饲料包括氨基酸混合物20～28％、玉米淀粉6～8％、麦芽糊精8～10％、蔗糖8～10％、纤维素5～8％、大豆油3～4％、猪油30～33％、碳酸氢钠0.5～1％、矿物质混合物5～8％、维生素混合物0.1～0.2％。

5、进一步地，以占饲料总质量的重量百分比计，所述氨基酸混合物包括蛋氨酸0.1～0.2％、丙氨酸0.6～0.7％、精氨酸0.7～0.8％、天门冬氨酸1～2％、胱氨酸0.5～0.6％、谷氨酸5～8％、甘氨酸0.3～0.4％、组氨酸0.6～0.7％、异亮氨酸1～2％、亮氨酸2～3％、、赖氨酸1～2％、苯丙氨酸1～2％、脯氨酸2～3％、丝氨酸1～2％、苏氨酸0.5～1％、色氨酸0.2～0.3％、酪氨酸1～2％、缬氨酸1～2％，不含胆碱。

6、进一步地，以占饲料总质量的重量百分比计，所述纯化饲料包括氨基酸混合物23.2％、玉米淀粉7.5％、麦芽糊精9.7％、蔗糖9.6％、纤维素6.6％、大豆油3.3％、猪油32.4％、碳酸氢钠1.0％、矿物质混合物6.6％、维生素混合物0.1％；其中，所述氨基酸混合物包括蛋氨酸0.1％、丙氨酸0.7％、精氨酸0.8％、天冬氨酸1.6％、胱氨酸0.6％、谷氨酸5.1％、甘氨酸0.4％、组氨酸0.6％、异亮氨酸1.0％、亮氨酸2.1％、赖氨酸1.7％、苯丙氨酸1.1％、脯氨酸2.4％、丝氨酸1.3％、苏氨酸1..0％、色氨酸0.3％、酪氨酸1.2％、缬氨酸1.2％。

7、进一步地，所述矿物质混合物为d12492混合矿物质，所述维生素混合物为d12492混合维生素。即，上述矿物质混合物为矿物质混合物s10026b，上述维生素混合物为维生素混合物v10001c。

8、进一步地，所述纯化饲料中的蔗糖和麦芽糊精通过细粉碎处理，所述麦芽糊精20目筛网中通过率要达到98％以上；所述蔗糖60目筛网中通过率要达到99％以上。上述措施可改良高脂饲料硬度偏低的问题。

9、本发明的第二个方面是提供本发明的第一个方面中任一所述的纯化饲料在构建非酒精性脂肪肝炎动物模型中的应用。

10、进一步地，所述构建非酒精性脂肪肝炎动物模型的方法包括：将实验小鼠经所述纯化饲料喂养4～8周，正常饮水，饲料喂养量为3～8克/只/天，获得所述非酒精性脂肪肝炎小鼠模型。

11、进一步地，所述小鼠为c57bl/6j小鼠，采用所述纯化饲料喂养6周，饲料喂养量为5克/只/天。

12、进一步地，饲喂小鼠6周后，所述非酒精性脂肪肝炎小鼠模型具有以下症状：小鼠发生明显肥胖，血清alt、ast、tg和vdl显著升高，hdl显著下降，肝脏体积增大，肝指数升高，肝脏内出现大量且大小不一的脂肪空泡和红色脂滴，脂肪沉积明显，小叶内炎性灶和肝细胞气球样变。

13、可理解的是，本发明采用小鼠模型进行示例性说明，上述纯化饲料也可用于构建其他动物模型(例如大鼠)，基于构建的动物模型不同，其饲料喂饲量及喂饲周期均需进行适应性调整。

14、本发明的第三个方面是提供一种构建非酒精性脂肪肝炎动物模型的方法，其采用本发明的第一个方面中任一所述的纯化饲料喂养实验小鼠6周，正常饮水，饲料喂养量为5克/只/天。上述小鼠优选为c57bl/6j小鼠。

15、本发明的第四个方面是提供一种非酒精性脂肪肝炎动物模型在筛选预防和/或治疗非酒精性脂肪肝炎的药物中的应用，其中所述非酒精性脂肪肝炎动物模型由喂饲如权利要求1～5中任一项所述的纯化饲料构建获得。

16、与现有技术相比，本发明采用上述技术方案具有以下有益效果：

17、现有技术中蛋氨酸胆碱缺乏饲料虽然可以在短时间内引起小鼠肝脏发生病变和炎症，但小鼠体重逐渐下降，甚至出现死亡；胆碱缺乏的高脂饲料可以保证小鼠体重增长，但引起小鼠肝炎病理变化的周期略长。

18、本发明针对现有技术问题研发的蛋氨酸微量、胆碱缺乏高脂饲料在保证小鼠体重增长和肝脏病变的基础上，缩短了造模周期，模型饲料的制备方法简单，小鼠自由采食且采食量良好。利用本发明提供的非酒精性脂肪肝炎动物模型饲料饲喂小鼠6周后，小鼠发生明显肥胖，血清alt、ast、tg、vdl显著升高，hdl显著下降，肝脏体积增大，肝指数升高，肝脏内出现大量且大小不一的脂肪空泡，小叶内炎性灶和肝细胞气球样变等病理变化，较好地模拟了实际人类非酒精性脂肪肝炎的病理表现，，为非酒精性脂肪肝炎治疗药物的快速研发与筛选提供了重要工具。