一种促进药用植物黄连种子萌发和无菌增殖的方法-k8凯发

本发明涉及黄连栽培，具体涉及一种促进药用植物黄连种子萌发和无菌增殖的方法。

背景技术：

1、黄连的种子有胚后熟休眠的习性，收获的时候种胚呈透明椭圆形的胚原基状，甚至是一团尚未成形的物质。黄连的胚后熟需要经历形态后熟与生理后熟这两个阶段。黄连种胚在形态发育早期，也就是心形胚时期，促进种胚发育的温度条件范围比较广泛，适合黄连种胚发育的温度大约5℃～20℃。当黄连的种胚由心形向长心形或鱼雷形发展时，在5℃～10℃的条件下能显著加速。黄连种子在采收之后，如果一直放在冰箱(5℃～10℃)内的层积里，可以在6～9个月之内完成形态的后熟，达到种子裂口。完成形态发育的黄连种子，还必须在0℃～5℃低温1～3个月才能完成生理后熟。完成生理后熟的黄连种子，在第二年的春天，气温达到11℃～14℃的时候整齐萌发。

2、且黄连在自然环境下携带大量真菌，且多数为内生真菌，这类真菌与植物组织深度寄生，采用传统消毒方式如直接使用酒精、次氯酸钠和高锰酸钾对其浸泡消毒，效果不佳。如何高效对黄连种子进行灭菌是获取黄连无菌种子、培育黄连无菌苗工作中亟待解决的难题。

3、传统技术(《db5107/t 109—2022黄连种子繁育技术规程》)中黄连种子萌发周期很长，对环境条件要求较高，不同的后熟阶段对光、温度、湿度以及贮藏方式的要求差异较大，一旦某一个或数个环节出现问题，将最终导致整批种子萌发失败，给生产带来较大影响。同时，因黄连特殊的内生真菌共生的生理模式，导致通过传统方式的萌发繁殖无法获取带菌较少的幼苗植株，给后续实验室获取无菌植株带来阻碍。

4、综上，研发一种通过本方法，可以大大加快黄连种子的后熟进度，提高萌发效率，同时降低萌发幼苗的带菌数量，为后续获取无菌植株提供有利条件。

技术实现思路

1、本发明意在提供一种促进药用植物黄连种子萌发和无菌增殖的方法，以解决现有黄连萌发率低的技术问题。

2、为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：一种促进药用植物黄连种子萌发和无菌增殖的方法，包括(一)筛选阶段；(二)后熟处理阶段，湿沙混合种子后遮光密封储存；(三)超声处理阶段，包括超声处理和赤霉素浸泡处理；(四)消毒阶段，依次使用乙醇和氯化汞溶液均对种子进行浸泡消毒。

3、本方案的原理及优点是：

4、1、本方案通过采用湿沙对黄连种子进行后熟处理，有效实现黄连种子形态构建与生理上的成熟，还能辅助黄连种子打破休眠状态，大大缩短黄连种子成熟至发芽的周期，促进种子快速破眠。而本方案通过在后熟处理后继续对种子进行超声处理，一方面可以有效破坏种皮和内壁，增加种子通透性，促进胚根和胚芽突破种皮分别长成根和芽，实现黄连种子的萌发；另一方面，超声处理还能有效改变种子中水分和营养成分的分布，增加其代谢能力而增加种子的活性，有利于其发芽和生长，从而提升黄连种子的发芽率。而在超声处理破坏黄连种子种皮后再以赤霉素浸泡刺激黄连种子，其相比于在湿沙层积处理前采用赤霉素浸泡黄连种子时，需要较高的赤霉素浓度且效果较差而言，本方案先经过后熟和超声处理，增加种皮通透性，便于赤霉素进入种子内部刺激种子萌发的同时，与超声增加种子活力协同从而有效提升黄连种子萌发率；且本方案赤霉素处理的顺序还能明显降低因传统处理流程需要的高浓度赤霉素对黄连种子造成的不可逆伤害，浸进而有效提高种子萌发效率和质量，降低黄连种子萌发成本。

5、2、本方案通过依次使用乙醇和氯化汞溶液对种子进行浸泡消毒，乙醇有效杀灭黄连种子表面细菌和除种皮表面角质，结合前面超声波处理增加了种皮的通透性，两者协同便于氯化汞进入种皮内部杀灭黄连内生菌；且乙醇还能作为有机溶剂溶解粘附在种皮表面的赤霉素，避免赤霉素长时间刺激种子而抑制种子萌发。在乙醇杀菌后再使用氯化汞杀菌，有效降低杀灭黄连种子中的病原菌和大部分内生菌，避免种子萌发过程中内生菌菌丝大量生长至包裹种子而影响种子萌发效果，大大降低了萌发幼苗的带菌数量，提升黄连种子萌发所得无菌苗比率，为后续获取无菌植株提供有利条件。

6、3、本方案突破传统思路，首创性地将消毒步骤设置在超声波处理和赤霉素处理之后，目的在于通过超声波处理，对种子产生刺激，改变种皮甚至细胞膜的通透性，促进赤霉素的吸收和消毒剂的渗透。同时，赤霉素对种皮的蜡质层具有不同程度的腐蚀作用,可以继续改变种皮通透性，从而进一步增强消毒剂的渗透作用。还通过合理设置超声条件和赤霉素浓度，能够协同促进种子萌发的同时，并显著提升消毒剂对黄连种子的灭菌效果。发明人通过长期实验发现，若是将杀菌步骤设置在后熟处理和超声处理之间(或设置在后熟处理之前)，会因黄连种子种皮通透性较差而显著降低杀菌效果，使得黄连种子萌发过程中易被内生菌菌丝包裹而无法萌发或无法成苗；而若是将杀菌步骤设置在超声和赤霉素浸泡之间，则此时会因种子还未完全打破休眠而导致低浓度氯化汞也能杀死大量种子，从而显著降低黄连种子的萌发率。

7、优选的，在(二)后熟处理阶段，包括采用湿度为65～75％、体积为种子5倍的湿沙，与黄连种子混合后遮光密封储存。

8、有益效果：本方案采用上述设置，便于促进黄连种子的生理性成熟和形态成熟，从而有效缩短种子萌发前的休眠期。

9、优选的，所述后熟处理的温度为4～7℃，后熟处理时间为90～120d。

10、有益效果：本方案采用上述设置，便于促进黄连种子的形态成熟和生理性成熟，从而有效缩短种子萌发前的休眠期。申请人通过长期实验发现，过高的后熟处理温度(如高于7℃)处理种子后，黄连种子破口的胚根会一夜变黄，全部死掉；发明人分析原因在于，采用过高的温度沙藏黄连种子，会快速提升黄连种子呼吸效率，使得种子内营养物质快速分解，反而不利于种子完成后熟；而过低的温度沙藏黄连种子，则会因为其后熟过程较为缓慢而需要更长的时间完成黄连种子的后熟过程；更有甚者，更低的后熟温度会使得湿沙中水温度过低冻伤黄连种子。而黄连种子内的内生菌较多，若是沙藏时间过长，也会导致种子萌发过程中内生菌菌丝生长而包裹种子，影响黄连种子萌发率。

11、优选的，在(一)筛选阶段，包括选取成熟、饱满且完整的5年生～7年生植株的新鲜黄连种子，将其浸于水中，静置分层后去除上层漂浮种子，取沉底种子通风阴干表面备用。

12、有益效果：本方案采用上述设置，选取更优质的黄连种子进行种子萌发，便于有效排除因种子的营养因素导致的不萌发，从而有效正确评估本方案对黄连种子萌发率的提升效果，提升种子萌发率。发明人实验发现，若是种子采收自低于5年生的黄连植株，则会因其自身发育不完全导致其种子活力低下，种子空瘪率极高；而若是种子采收自高于7年生的黄连植株，则会因植株老化而降低种子活力，从而降低种子萌发率。

13、优选的，在(三)超声处理阶段前，包括将后熟处理所得种子浸水后去除上层漂浮种子，取沉底种子以滤纸干燥后备用。

14、有益效果：本方案采用上述设置，便于去除层积处理后不同批次种子的后熟效果差异对种子萌发效果的影响，从而提升黄连种子萌发率。发明人通过实验发现，经过后熟处理，健康成熟的黄连种子更加充实、饱满，不健康的黄连种子则空瘪率高，导致其浮力较大，故浸泡时会悬浮于水面上，去掉漂浮种子，便于简单有效的筛选得到后熟比较完善的黄连种子，有效提升萌发率。

15、优选的，在(三)超声处理阶段，包括将种子于10～20℃条件下超声处理30～60min。

16、有益效果：本方案采用上述设置，便于破坏后熟处理后黄连种子的种皮及内壁，从而便于赤霉素进入种子对种子萌发起作用，不仅有效提升种子萌发率，还能提升赤霉素溶液的利用率，降低黄连种子萌发的试剂成本。发明人通过长期实验发现，若是超声时间过短，种皮表面角质清理不充分，会导致种皮通透性不佳，外源激素赤霉素无法顺利透过种皮进入种子，从而不利于打破休眠。同时种子自然解除休眠也与种皮通透性有关，种子越接近萌发，种皮通透性越好，故过短的超声时间不利于休眠的打破。过长的超声时间则会破坏种皮结构，甚至破坏胚乳和胚芽，对种子造成不可逆损伤，从而不利于种子萌发。此外，种子后熟处理过程中，温度没超过7℃，本方案在超过7℃(具体超声温度为10～20℃)的温度条件下进行超声，还能给种子一个温度信号刺激，有助于打破种子后熟阶段休眠，促进萌发。

17、优选的，所述赤霉素浸泡处理为将种子于0.1～0.2mg/l的赤霉素溶液中浸泡24～48h。

18、有益效果：本方案采用上述设置，便于有效提升黄连种子萌发率。且申请人通过长期实验发现，相比在湿沙层积处理前采用赤霉素浸泡，本方案在层积处理和超声处理后采用赤霉素溶液浸泡黄连种子，不仅有效提升黄连种子萌发率，且还能明显降低浸泡黄连种子所需赤霉素溶液浓度，进而有效减少黄连种子萌发阶段的赤霉素用量，降低黄连种子萌发成本。具体的，相比于现有技术“赤霉素处理后层积对鲜黄连种子萌发的影响”(宋金雨等，东北林业大学学报，2021；本方案对比例16)采用浓度为500mg/l的赤霉素溶液浸泡黄连种子48h后，在20℃环境下沙藏30d，再转入10℃环境沙藏90d后，黄连种子的萌发率达31.11％，其远低于本方案处理后黄连种子的萌发率(如实施例2，本方案将黄连种子沙藏90d、超声60min后，以0.2mg/l的赤霉素溶液浸泡，所得黄连种子萌发率高达85.3％)。发明人分析其原因在于，本方案先经过沙藏(即后熟处理)和超声，有效提升种皮通透性，便于赤霉素浸泡时透过种皮进入种子内部，赤霉素与黄连种子胚轴和胚芽尖端细胞内的赤霉素受体结合，激活受体下游的信号传导途径(如磷酸化、蛋白激活)，从而影响细胞内的基因表达和蛋白质合成，打破种子休眠，促进黄连种子萌发。而本方案在赤霉素接触种子时，种子已完成后熟，且超声处理提升了种皮通透性，其以更加成熟的种子结构和营养状态接触赤霉素，从而使赤霉素的作用效果更加有效且高效。

19、且，发明人通过长期实验发现，随着赤霉素溶液浓度升高，黄连种子的萌发率呈现先上升后下降的过程，如相比于本方案实施例2黄连种子萌发率高达85.3％而言，对比例13中采用0.5mg/l赤霉素溶液浸泡黄连种子时，黄连种子的萌发率反而降低至34.7％。发明人分析其原因在于，高浓度的赤霉素反而会抑制黄连种子萌发。

20、优选的，在(四)消毒阶段，使用乙醇消毒前包括对种子进行流水冲洗5-10min。

21、有益效果：本方案采用上述设置，便于去除种子表面赤霉素，从而有效避免赤霉素长时间停留在种子表面，使得赤霉素处理时间过长而导致种子萌发受到抑制，反而降低种子萌发率。

22、优选的，在(四)消毒阶段，乙醇对种子消毒的步骤如下：采用75％乙醇溶液浸泡种子40-60s后以无菌水清洗种子3～5次；氯化汞对种子消毒的步骤如下：采用0.1～0.2％氯化汞溶液浸泡种子10～15min后以无菌水清洗种子3～5次。

23、有益效果：本方案采用上述设置，便于对种子表面染菌进行全面消杀，且能杀灭大部分黄连种子的内生菌，从而有效降低萌发幼苗的带菌数量，提升萌发所得无菌苗数量。发明人还通过长期实验发现，若是只采用乙醇/高锰酸钾溶液对黄连种子进行杀菌，则只能杀灭黄连种子表面细菌，对种子内部内生菌的杀灭效果较差，会导致萌发所得幼苗的带菌数量上升，影响其后续种植和研究；且单独使用高锰酸钾对黄连种子杀菌，因完成后熟的黄连种子呈破口状态，其胚芽和胚乳处于半裸露状态，高锰酸钾直接处理会造成黄连种子染色，影响实验人员对黄连种子活性的判断。而若是单独使用氯化汞溶液浸泡黄连种子杀菌，则会因内生菌、外染菌较多而降低其菌效果，此时若是提升氯化汞溶液浓度以提升杀菌效果，则会连黄连种子一起杀死，从而降低种子萌发率。而本方案采用乙醇和氯化汞组合杀菌则能以较低的浓度和较短的杀菌时间实现对黄连种子全面杀菌。在此基础上，发明人还发现，若是乙醇和氯化汞溶液用量过少、浸泡时间过短、氯化汞溶液浓度过低，均会无法全面杀菌；而若是乙醇或氯化汞溶液浸泡时间过长或氯化汞溶液浓度过高，则会因发生药害(如酒精中毒)而杀灭种子，从而降低种子萌发率，得不偿失。

24、此外，本方案在乙醇、氯化汞浸泡杀菌前后均采用无菌水多次冲洗种子，便于清除上一阶段处理试剂残留对种子的影响，从而便于后续试剂充分发挥杀菌效果，提升种子萌发率。

25、优选的，在(四)消毒阶段后，还包括将种子与灭菌的培养基质以1:5的体积比混合后培养30～45天，每天的培养条件如下：先置于11000lux、6℃条件下培养8h，再置于8000lux、6℃条件下培养4h，然后置于6000lux、4℃条件下培养4h，最后置于0lux、4℃条件下培养8h。

26、有益效果：本方案采用上述设置，便于缩短黄连种子萌发时间，促进其快速萌发。发明人通过长期实验发现，若采用两段式光照强度培养黄连种子(如2000～20000lux、6℃条件下培养16h后在0lux、4℃条件下培养8h)，或三段式光照强度培养黄连种子(如先在11000lux、6℃条件下培养12h后，在4000～8000lux、4～6℃条件下培养4h，最后置于0lux、4℃条件下培养8h)，均会影响黄连种子的成苗，降低黄连种子的成苗率。而若是本方案四段式培养时暗处理时间短于6h，则会导致黄连幼苗叶片发黄，培养时间影响黄连幼苗的健康状态。