一种采用uplc法检测复方甘草口服溶液中有效成分含量的方法
技术领域
1.本发明涉及药物分析领域中的一种采用uplc法检测复方甘草口服溶液中有效成分含量的方法。
技术背景
2.复方甘草口服溶液，英文名为compound glycyrrhiza oral solution，本品为棕色或棕黑色液体；有香气，久置偶有沉淀。复方甘草口服溶液收载于《中国药典》2020年版二部，主要由甘草流浸膏、复方樟脑酊、愈创甘油醚、甘油、浓氨溶液等组成，是治疗上呼吸道感染、支气管炎和感冒时所产生的咳嗽及咳痰不爽的常用药。其中，甘草流浸膏为保护性祛痰剂；复方樟脑酊为镇咳药；愈创甘油醚为祛痰止咳剂，并有一定的防腐作用；甘油、浓氨溶液为辅料，可保持制剂稳定，防止沉淀生成及析出。上述成分组成复方制剂，有镇咳、祛痰的协同作用。《中国药典》(2020年版)中复方甘草口服溶液有效成分吗啡、愈创甘油醚与甘草酸分别采用两个完全不同的液相色谱系统进行检测，其中吗啡测定时，样品首先在固相萃取柱提取后，于辛烷基硅烷键合硅胶柱检测，该方法操作复杂、精密度低、耗时长、成本高；愈创甘油醚与甘草酸测定时，对高效液相色谱系统的要求非常高，否则愈创甘油醚及甘草酸与其相邻杂质峰的分离度达不到要求。目前为止，尚没有检索到关于同时测定复方甘草口服溶液有效成分含量的方法。因此，研制开发一种同时测定复方甘草口服溶液中有效成分的检测方法一直是亟待解决的新课题。
技术实现要素：
3.本发明的目的在于提供一种采用uplc法检测复方甘草口服溶液中有效成分含量的方法，该方法采用uplc法(流动相浓度、梯度淋洗、变波长法)进行检测，该方法具有可同时检测多种有效成分含量、试剂易得、操作简便、检测周期短、精密度高等优点。
4.本发明的目的是这样实现的：一种采用uplc法检测复方甘草口服溶液中有效成分含量的方法，该检测方法包括如下步骤：
5.(1)色谱条件：
6.色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
7.流动相：磷酸盐缓冲液和乙腈
8.所述色谱条件采用流动相浓度、梯度淋洗，变波长法；
9.(2)磷酸盐缓冲液的制备
10.(3)供试品溶液的制备
11.(4)对照品溶液的制备
12.(5)测定方法：
13.精密量取对照品溶液及供试品溶液注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中，所述有效成分峰与相邻色谱峰的分离度应符合要求，按外标法以峰面积计算；
14.所述有效成分选自吗啡、愈创甘油醚、甘草酸中的一种或几种；所述色谱柱的规格选自(30-150)
×
(1.8-2.5)mm，1.6-10μm；优选的，所述色谱柱的规格包括选自(75-150)
×
(2.0-2.2)mm，2-3.5μm；所述色谱柱的品牌选自halo、waters、安捷伦、迪马、资生堂；所述供试品溶液色谱图中，吗啡峰的理论板数不得低于2000；
15.所述磷酸盐缓冲液的制备方法包括如下步骤：取磷酸盐，加水溶解，加入三乙胺，用有机酸溶液调ph至弱酸性；所述磷酸盐选自磷酸二氢钾、磷酸氢二钾中的一种或几种；所述有机酸选自磷酸、醋酸中的一种或几种；所述弱酸性指ph为3.5-5.5；优选的，所述弱酸性指ph为4-5；所述有机酸的浓度选自1-30％；优选的，所述有机酸的浓度选自5-20％；所述磷酸盐的质量：所述水的体积：所述三乙胺的体积＝(1-10):(500-1500):(0.5-10)，所述质量的单位为克，所述体积的单位为毫升；优选的，所述磷酸盐的质量：所述水的体积：所述三乙胺的体积＝(2-5):(800-1250):(1-5)，所述质量的单位为克，所述体积的单位为毫升；
16.所述色谱条件还包括：柱温：20℃～45℃；优选的，柱温：25℃～40℃；流速：0.25ml/min～0.38ml/min；优选的，流速：0.30ml/min～0.36ml/min；紫外检测器波长：210-230nm、240-260nm；优选的，紫外检测器波长：215-225nm、245-255nm；进样量：0.5μl～5μl；优选的，进样量：0.5μl～2μl；
17.所述供试品溶液的制备包括如下步骤：取所述复方甘草口服溶液，超声，置容量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液；所述超声的时间为1-60min，优选的，所述超声的时间为1-30min；
18.所述对照品溶液的制备包括如下步骤：精密称取吗啡、愈创甘油醚和甘草酸铵中的一种或几种，置于容量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，制成对照品溶液；所述对照品溶液中吗啡的含量为0.005-0.03mg/ml；优选的，所述对照品溶液中吗啡的含量为0.008-0.02mg/ml；所述对照品溶液中愈创甘油醚的含量为0.1-2mg/ml；优选的，所述对照品溶液中愈创甘油醚的含量为0.2-1mg/ml；所述对照品溶液中甘草酸的含量为0.05-1mg/ml；优选的，所述对照品溶液中甘草酸的含量为0.15-0.5mg/ml；
19.所述稀释剂的制备包括如下步骤：取醋酸、水、甲醇，混匀；所述醋酸选自冰醋酸；所述醋酸、水、甲醇的体积比为(1-10):(100-1000):(100-1000)；优选的，所述醋酸、水、甲醇的体积比为(2-8):(200-800):(200-800)；所述流动相浓度、梯度淋洗，变波长法包括如下步骤：
[0020][0021]
所述磷酸盐缓冲液与乙腈为体积比；
[0022]
优选的，所述流动相浓度、梯度淋洗，变波长法包括如下步骤：
[0023][0024]
所述磷酸盐缓冲液与乙腈为体积比；
[0025]
所述流动相浓度、梯度淋洗，变波长法包括如下步骤：
[0026][0027]
所述磷酸盐缓冲液与乙腈为体积比；
[0028]
优选的，所述流动相浓度、梯度淋洗，变波长法包括如下步骤：
[0029][0030][0031]
所述磷酸盐缓冲液与乙腈为体积比；
[0032]
所述按外标法以峰面积计算的公式为：
[0033][0034]a供
：供试品溶液中相应有效成分的峰面积；
[0035]a对
：对照品溶液中相应有效成分的峰面积；
[0036]c对
：对照品溶液中相应有效成分对照品的浓度，mg/ml；
[0037]
p
对
：相应有效成分对照品的纯度；
[0038]
计算甘草酸含量时应在所述公式中的分子乘以换算系数0.9797。
[0039]
本发明的要点在于它的检测方法，采用uplc(浓度、梯度淋洗、变波长法)进行检测。
[0040]
一种采用uplc法检测复方甘草口服溶液中有效成分含量的方法与现有技术相比，具有可同时检测多种有效成分含量、试剂易得、操作简便、每批检测时间由2天缩短为不到1天、精密度高等优点，将广泛地应用于药物分析领域中。
附图说明
[0041]
下面结合附图及实施例对本发明进行详细说明。
[0042]
图1是本发明实施例一的对照品溶液uplc色图谱。
[0043]
图2是本发明实施例一的供试品溶液uplc色图谱。
具体实施方式
[0044]
下述实例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。
[0045]
实施例一
[0046]
1.色谱条件
[0047]
色谱柱：halo c18 100
×
2.1mm 2.7μm，柱温：35℃，流速：0.35ml/min，检测波长：220nm、250nm，进样量：1μl。
[0048]
2.溶液制备
[0049]
2.1流动相：磷酸盐缓冲液为流动相a，乙腈为流动相b
[0050]
2.2磷酸盐缓冲液：取磷酸二氢钾3.4g，加水1000ml溶解，加入三乙胺2.5ml，用10％磷酸溶液调ph至4.5。
[0051]
2.3稀释剂：取5ml冰醋酸，加水至500ml，混匀，加入500ml甲醇，摇匀，即得。
[0052]
2.4供试品溶液：取复方甘草口服溶液(东北制药集团沈阳第一制药有限公司，100ml/瓶，批号191206)1瓶，超声10分钟，放冷，精密量取复方甘草口服溶液5ml，置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。
[0053]
2.5对照品溶液：精密称取吗啡对照品10mg，置100ml量瓶中，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为吗啡对照品贮备溶液；分别精密称取愈创甘油醚对照品25mg、甘草酸铵对照品12.5mg，置同一50ml量瓶中，精密加入吗啡对照品贮备溶液5ml，用稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液。
[0054]
3.测定方法
[0055]
采用流动相磷酸盐缓冲液和乙腈浓度、梯度淋洗、变波长法；
[0056][0057]
上表中，流动相a与流动相b为体积比。
[0058]
参见附图2，供试品溶液色谱图中，吗啡峰的理论板数为3172，吗啡峰与相邻色谱峰(图2所示的距离吗啡峰最近的箭头所指的相邻色谱峰)的分离度为1.8、愈创甘油醚峰与相邻色谱峰(图2所示的距离愈创甘油醚峰最近的箭头所指的相邻色谱峰)的分离度为1.8、甘草酸与相邻色谱峰(图2所示的距离甘草酸峰最近的箭头所指的相邻色谱峰)的分离度为1.6。
[0059]
精密量取对照品溶液和供试品溶液各0.5μl～5μl注入液相色谱仪，记录色谱图。
[0060]
4.计算结果
[0061]
4.1吗啡含量
[0062]
对照品溶液1吗啡峰面积：93.78 95.00 93.80 94.68 94.04
[0063]
平均值：94.26 rsd：0.6％
[0064]
对照品溶液2吗啡峰面积：95.76 96.45平均值：96.10
[0065]
对照品平均称样量：(10.49 10.81)/2＝10.65
[0066]
对照品平均峰面积：(94.26 96.10)/2＝95.18
[0067]
供试品溶液1吗啡峰面积：96.48 97.39平均值：96.93
[0068]
供试品溶液2吗啡峰面积：96.42 96.74平均值：96.58
[0069][0070][0071]
平均值：0.1013mg/ml
[0072]
4.2愈创甘油醚含量
[0073]
对照品溶液1愈创甘油醚峰面积：130.46 130.87 130.92 130.93 130.43
[0074]
平均值：130.72 rsd：0.2％
[0075]
对照品溶液2愈创甘油醚峰面积：128.57 128.87平均值：128.72
[0076]
对照品平均称样量：(25.37 25.13)/2＝25.25
[0077]
对照品平均峰面积：(130.72 128.72)/2＝129.72
[0078]
供试品溶液1愈创甘油醚峰面积：126.36 127.13平均值：126.74
[0079]
供试品溶液2愈创甘油醚峰面积：126.16 126.28平均值：126.22
[0080][0081][0082]
平均值：4.904mg/ml
[0083]
4.3甘草酸含量
[0084]
对照品溶液1甘草酸峰面积：523.40 535.58 527.67 527.54 523.36
[0085]
平均值：527.51 rsd：1.0％
[0086]
对照品溶液2甘草酸峰面积：523.74 525.28平均值：524.51
[0087]
对照品平均称样量：(12.64 12.70)/2＝12.67
[0088]
对照品平均峰面积：(527.51 524.51)/2＝526.01
[0089]
供试品溶液1甘草酸峰面积：587.27 589.43平均值：588.35
[0090]
供试品溶液2甘草酸峰面积：584.91 585.81平均值：585.36
[0091][0092][0093]
平均值：2.61mg/ml
[0094]
表1复方甘草口服溶液有效成分测定结果
[0095][0096]
实施例二
[0097]
方法学考察
[0098]
本研究对本方法的线性、重复性、准确度和稳定性进行了较为系统的考察。
[0099]
1、线性试验
[0100]
1.1吗啡线性试验
[0101]
精密称取吗啡对照品10mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀；再精密量取4ml、4.5ml、5ml、5.5ml、6ml分别置5个50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，得到浓度为80％、90％、100％、110％、120％的系列对照品溶液，按照实施例一中色谱条件进样分析，以吗啡浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，结
果表明吗啡浓度在7.6602μg/ml～11.4903μg/ml范围内线性关系良好。
[0102]
1.2愈创甘油醚线性试验
[0103]
精密称取愈创甘油醚对照品10mg、11.2mg、12.5mg、13.8mg、15mg，分别置25ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为80％、90％、100％、110％、120％的系列对照品溶液，按照实施例一中色谱条件进样分析，以愈创甘油醚浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，结果表明愈创甘油醚浓度在402.78μg/ml～635.84μg/ml范围内线性关系良好。
[0104]
1.3甘草酸线性试验
[0105]
精密称取甘草酸铵对照品10.8mg、12.1mg、13.5mg(相当于甘草酸12.5mg)、14.8mg、16.2mg，分别置50ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，得到浓度为80％、90％、100％、110％、120％的系列对照品溶液，按照实施例一中色谱条件进样分析，以甘草酸浓度(x)为横坐标，以峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，结果表明甘草酸浓度在194.95μg/ml～310.19μg/ml范围内线性关系良好。
[0106]
表2复方甘草口服溶液有效成分线性试验测定结果
[0107]
有效成分名称线性方程相关系数吗啡y＝9.61328x-0.96744r＝0.99994愈创甘油醚y＝0.2516x 5.0451r＝0.9991甘草酸y＝2.1203x 46.4767r＝0.9990
[0108]
2、重复性试验
[0109]
取本品1瓶，超声10分钟，放冷，精密量取本品5ml六份，分别置50ml量瓶中，用稀释剂稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。按照实施例一中色谱条件进样分析，以测定的含量结果(见表3)，计算吗啡rsd值为0.2％、愈创甘油醚rsd值为0.4％、甘草酸rsd值为0.6％，表明方法的重复性良好。
[0110]
表3复方甘草口服溶液重复性测定结果
[0111][0112]
3、准确度试验
[0113]
空白辅料溶液：称取处方量辅料，置100ml量瓶中，加水溶解稀释至刻度，摇匀，作为空白辅料溶液。
[0114]
精密称定吗啡对照品10mg，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，作为吗啡对照品贮备溶液。精密称定愈创甘油醚对照品20mg、25mg、30mg和甘草酸铵对照品10mg、12.5mg、15mg各三份，置9个50ml量瓶中，精密加入吗啡对照品贮备溶液4ml、5ml、6ml各三份，分别加空白辅料溶液5ml，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，用0.22μm滤膜滤过，取续滤液作为供试品溶液。按照实施例一中色谱条件进样分析，根据公式“回收率＝回收量/加入量
×
100％”计算回收率(见表4)，结果表明，吗啡的平均回收率为99.5％、rsd值为
0.7％；愈创甘油醚的平均回收率为99.6％、rsd值为0.7％；甘草酸的平均回收率为100.0％、rsd值为0.5％，rsd均小于1％，表明样品的回收率良好。
[0115]
表4复方甘草口服溶液准确度测定结果
[0116][0117]
[0118][0119]
4、稳定性试验
[0120]
按照实施例一中色谱条件，分别在0h、1h、2h、4h、6h、8h、12h、18h进样，所对应的含量计算(见表5)，吗啡rsd值为0.4％，愈创甘油醚rsd值为0.4％，甘草酸rsd值为0.4％，表明样品在18小时内稳定性良好。
[0121]
表5复方甘草口服溶液稳定性测定结果
[0122]