一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺的制作方法-k8凯发

本发明涉及生物工程，具体是一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺。

背景技术：

1、糖尿病是目前在世界范围内广泛存在的慢性疾病之一。尤其是2型糖尿病(t2dm)，其患者人数占糖尿病总人数的90％以上；与1型糖尿病(t1dm)患者大多为幼年患者不同，t2dm患者大多为中老年人群。t1dm多是因自身免疫或遗传因素造成β细胞功能缺陷，以致胰岛素分泌绝对不足，需外源胰岛素辅助降糖；而t2dm多是因生活习惯不健康、饮食结构不科学、工作压力过大以及自身遗传背景等一系列体内外因素的互作造成。首先，各种因素导致机体胰岛素抵抗、空腹葡萄糖和糖耐量受损，造成胰岛素分泌相对不足；其次，持续性高血糖使机体代偿性胰岛素分泌大大增加，此举加快了胰腺β细胞的应激性衰竭；最终，随着体内糖脂毒性的升高，胰腺β细胞的破坏被进一步加剧。

2、近年来，糖尿病的发病率逐年上升，已经成为仅次于心血管和肿瘤疾病，成为威胁人类健康的第三大疾病。根据我国卫生部门的统计结果显示，我国糖尿病患者高达1.41亿。治疗糖尿病及其并发症的医疗费用成为各国的卫生医疗体系的沉重负担。因此，寻找治疗该疾病的办法，开发治疗糖尿病的新途径及新药物的任务非常紧迫。

3、大豆肽是大豆蛋白水解物，大豆肽具有诸多的生理活性，包括降血糖、降血脂、降血压、增强免疫力等诸多生理功能。本发明旨在通过生物提取并通过进一步分离纯化得到大豆来源具有降糖活性的多肽，进而通过改善胰岛素的抵抗状态和葡萄糖的耐受水平来调节空腹血糖浓度。因此大豆来源的多肽可以作为一个天然的、可口服的、无毒的豆类生物活性多肽，可作为治疗2型糖尿病的一个非常有前景的候选药物或保健食品。

技术实现思路

1、本发明提供一种改善胰岛素的抵抗状态和葡萄糖的耐受水平来调节空腹血糖浓度的大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺。

2、本发明所采用的技术方案为：一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺，包括具体制备步骤如下：

3、(1)首先，量取100l无离子水升温至25℃，加入80kg洗泡干净的非转基因黄豆，充分浸泡3～5h后进行复水，然后过滤掉全部的无离子水，将复水后的黄豆放置萌发培养箱中进行萌发培养；

4、(2)往酶解罐中加入200l无离子水，将第一步培养完成的黄豆加入其中，用胶体磨将其充分破碎；

5、(3)用冰乙酸加入其中调节ph至3.5左右，室温提取6h后停止提取；

6、(4)将提取完的提取液进行离心处理，离心条件为10000转/分钟，上清液采用陶瓷膜进一步处理，固体大豆渣用纤维素酶简单处理后，接种枯草芽孢杆菌进行纳豆激酶的制作；

7、(5)将经离心处理后的水解液用的陶瓷膜过滤处理，处理压力为1.2mpa，流速稳定至2000l/h，陶瓷膜可以将脂肪大分子蛋白以及其他杂质充分过滤掉，极大提升产品的品质；

8、(6)将经陶瓷膜过滤后的酶解液用的有机过滤膜处理，处理压力为2.3mpa，流速稳定在2800l/h，用有机膜浓缩后的水解液提高浓度至32％～36％，后进行冷冻干燥处理，最终得到颜色率黄，口感微甜的大豆肽；

9、(7)各种基本理化指标检测，具体为大豆肽分子量分布、氨基酸分布的指标。

10、作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)中具体萌发培养条件为：温度25℃，每隔30min进行淋水处理一次，培养20～25h后结束萌发培养。

11、作为本发明进一步的方案：所述陶瓷膜的孔径为1.2μm孔径。

12、作为本发明进一步的方案：所述有机过滤膜的孔径为10nm孔径。

13、作为本发明进一步的方案：还包括豆肽的分离纯化：采用体外抗α-葡萄糖苷酶试验，分析大豆肽中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的多肽序列并采用层析色谱和制备型液相分离后选择具有较强抑制α-葡萄糖苷酶活性的组分继续利用分析性液相对大豆肽抑制α-葡萄糖苷酶活性组分进行分离纯化，最后采用液质联用技术对强抑制α-葡萄糖苷酶活性的组分进行氨基酸序列鉴定；

14、将经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的大豆肽利用高效液相色谱进行分离纯化，并将经分离纯化后的多肽组分参考具体的方法，进行α-葡萄糖苷酶抑制率的测定，并最终进行氨基酸序列结构的鉴定；

15、采用制备型高效液相色谱仪对经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的大豆肽进行分离纯化：

16、流动相a：0.1％三氟乙酸 99.9％超纯水；流动相b：0.1％三氟乙酸 99.9％乙腈；

17、检测波长：214nm；检测时间36min；柱温：21℃～25℃；

18、采用流动相a以5ml/min的速度平衡6个柱体积，直到基线稳定为止；

19、将得到的大豆肽混合物用流动相a溶解，配制样品的浓度为10mg/ml，10000r/min离心5min，上清液采用0.22μm的滤膜过滤处理，上样量为15ml；

20、采用流动相a和流动相b的混合液进行梯度洗脱，洗脱梯度如下：

21、0至5min流动相b浓度由0％梯度上升到5％；5至30min，流动相b浓度由5％梯度上升到80％；30至40min始终保持用浓度为80％的流动相b洗脱；40至45min流动相b浓度由80％梯度下降到5％；

22、接着进行接样，冷冻干燥后进行α-葡萄糖苷酶的抑制活性检测；

23、对经胃蛋白酶和胰蛋白酶消化后的大豆肽的10个组分进行α-葡萄糖苷酶抑制率进行测定，并针对激活率较高的组分进一步分离纯化，并利用液质联用系统对组分6进行氨基酸序列结构鉴定；采用纳升级液相色谱-q exactive质谱联用系统，对实施例4得到的组分6进行纯度和结构鉴定，其氨基酸结构为shniletsfhsefeeinrvllgeeeeqrq将其命名为a1，其分子量为3498.665da，通过液质联用技术测定a1在大豆肽(经体内消化后)质量百分含量为1.35％。

24、本发明的有益效果：

25、本发明通过生物提取并通过进一步分离纯化得到大豆来源具有降糖活性的多肽，进而通过改善胰岛素的抵抗状态和葡萄糖的耐受水平来调节空腹血糖浓度。因此大豆来源的多肽可以作为一个天然的、可口服的、无毒的豆类生物活性多肽，可作为治疗2型糖尿病的一个非常有前景的候选药物或保健食品。

26、本发明能够生产出高纯度和生物活性的类肠促胰岛素，以帮助管理糖尿病和其他胰岛素相关疾病。使用大豆等可再生资源，减少对动物源材料的依赖，有助于可持续制药生产。采用这种工艺可以降低制备类肠促胰岛素的生产成本，使其更加经济可行。与某些动物源胰岛素相比，大豆来源的类肠促胰岛素可能降低过敏反应的风险。本发明可以根据需要调整，以生产不同类型和规格的类肠促胰岛素。从而有助于改善胰岛素的生产和可用性，从而改善糖尿病患者的生活质量。

技术特征：

1.一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺，其特征在于：包括具体制备步骤如下：

2.根据权利要求1所述的一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺，其特征在于：所述步骤(1)中具体萌发培养条件为：温度25℃，每隔30min进行淋水处理一次，培养20～25h后结束萌发培养。

3.根据权利要求1所述的一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺，其特征在于：所述陶瓷膜的孔径为1.2μm孔径。

4.根据权利要求1所述的一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺，其特征在于：所述有机过滤膜的孔径为10nm孔径。

5.根据权利要求1所述的一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺，其特征在于：还包括豆肽的分离纯化：采用体外抗α-葡萄糖苷酶试验，分析大豆肽中具有抑制α-葡萄糖苷酶活性成分的多肽序列并采用层析色谱和制备型液相分离后选择具有较强抑制α-葡萄糖苷酶活性的组分继续利用分析性液相对大豆肽抑制α-葡萄糖苷酶活性组分进行分离纯化，最后采用液质联用技术对强抑制α-葡萄糖苷酶活性的组分进行氨基酸序列鉴定；

技术总结
本发明涉及生物工程技术领域，具体是一种大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺。包括具体制备步骤如下：量取100l无离子水升温至25℃，加入80kg洗泡干净的非转基因黄豆，充分浸泡3～5h后进行复水，然后过滤掉全部的无离子水，将复水后的黄豆放置萌发培养箱中进行萌发培养；往酶解罐中加入200l无离子水，将第一步培养完成的黄豆加入其中，用胶体磨将其充分破碎；用冰乙酸加入其中调节ph至3.5左右，室温提取6h后停止提取；将提取完的提取液进行离心处理，上清液采用陶瓷膜进一步处理，固体大豆渣用纤维素酶简单处理后，接种枯草芽孢杆菌进行纳豆激酶的制作。本发明提供一种改善胰岛素抵抗和葡萄糖的耐受水平来调节空腹血糖浓度的大豆来源的类肠促胰岛素制备工艺。

技术研发人员：张钊,魏玮,张会,李会允,王芳,王惠娟
受保护的技术使用者：中食都庆（山东）生物技术有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/2/8