1.本发明属于天然产物提取和应用领域，尤其涉及一种从菥蓂籽中提取当药黄素的方法及抗抑郁应用。
背景技术：
2.菥蓂籽为十字花科一年生草本植物菥蓂(thlaspi arvense l.)的成熟种子，具有清热解毒、明目、除湿、温和止痛等功效，对于五脏皆有滋补之效。另外，有相关研究表明，菥蓂籽具有抗抑郁作用。
3.当药黄素(swertisin)为淡黄色粉末状固体，黄酮苷类化合物，分子式是c
22h22o10
，分子量446.40。有抗氧化，抗炎，降血糖，治疗肿瘤等功效，近年来人们研究发现当药黄素还有治疗神经炎症、保护神经细胞和抗抑郁作用。
4.目前对当药黄素分离纯化方法研究较少，因此本发明以菥蓂籽为原料提取分离纯化当药黄素，并应用于抗抑郁方面。
技术实现要素：
5.有鉴于此，本发明解决技术缺陷并提供一种从菥蓂籽中提取当药黄素的方法及抗抑郁应用。
6.基于上述目的，本发明采用技术方案如下：
7.粉碎：将菥蓂籽在50-60℃进行烘干24小时，然后用粉碎机粉粹，过40-60目筛，得菥蓂籽粉末；
8.脱脂：取干燥菥蓂籽粉末用滤纸包好，置于索氏提取器中，加入石油醚热回流脱脂3h后低温挥干，得到的粉料同法再脱脂两次，菥蓂籽脱脂粉料；
9.提取及初富集：用乙醇对菥蓂籽脱脂粉料进行微波加热回流提取，然后收集水相进行旋转蒸发，并用正丁醇萃取富集，对提取液减压旋转蒸发至浸膏；
10.分离：将浸膏复溶于水中，用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发、冷冻干燥，得组分ⅰ、ⅱ、iii和ⅳ；
11.纯化：取组分ⅱ，用甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱法提纯，减压干燥后得纯当药黄素。
12.可选的，所述半制备高效液相色谱法包含如下工艺参数：
13.色谱柱：c18制备液相柱，规格为：250mm
×
10mm
×
5μm；流动相：乙腈(a)和0.1％的磷酸-水(b)，柱温25℃，检测波长为335nm。
14.可选的，所述半制备高效液相色谱法包含如下操作步骤：
15.梯度洗脱：0～5min采用10～17％乙腈溶液进行洗脱，5～10min采用17～19％乙腈溶液进行洗脱，10～25min采用19～26％乙腈溶液进行洗脱，25～26min采用26～10％乙腈溶液进行洗脱，26～28min采用10～10％乙腈溶液进行洗涤；
16.添加0.1％的磷酸水溶液至流动相中，检测并收集各流出物洗脱峰，得到保留时间
为10.63min，然后减压旋转蒸发冻干，得到纯当药黄素。
17.可选的，所述提取及初富集中微波加热回流提取方法，微波功率420w，微波时间156s，料液比1:14，乙醇浓度54％。
18.可选的，所述分离中梯度洗脱的材料为ab-8大孔树脂柱，乙醇水溶液的浓度依次为20％、30％、50％和70％。
19.可选的，所述分离中乙醇水溶液的用量为10bv，流速为5ml/min。
20.可选的，所述白扁豆花黄酮类化合物具有抗抑郁作用。
具体实施方式
21.为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本公开进一步详细说明。
22.粉碎：将菥蓂籽进行烘干，然后用粉碎机粉粹，过筛，得菥蓂籽粉末；
23.脱脂：取干燥菥蓂籽粉末用滤纸包好，置于索氏提取器中，加入石油醚热回流脱脂3h后低温挥干，得到的粉料同法再脱脂两次，菥蓂籽脱脂粉料；
24.提取及初富集：用乙醇对菥蓂籽脱脂粉料进行微波加热回流提取，然后收集水相进行旋转蒸发，并用正丁醇萃取富集，对提取液减压旋转蒸发至浸膏；
25.分离：将浸膏复溶于水中，用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱，收集洗脱液，依次对洗脱液进行减压旋蒸发、冷冻干燥，得组分ⅰ、ⅱ、iii和ⅳ；
26.纯化：取组分ⅱ，用甲醇溶解，采用半制备高效液相色谱法提纯，减压干燥后得纯当药黄素。
27.同时本说明书一个或多个实施例提供了一种从菥蓂籽中提取当药黄素的方法，采用上述所述的制备方法制备而成。
28.首先将菥蓂籽进行粉碎，然后用索氏提取法用石油醚脱脂得到菥蓂籽脱脂粉末，然后采用不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱得到4种成分，然后采用半制备高效液相色谱法对4种组分中的组分ⅱ进行提纯，最终制备出的纯当药黄素，所述当药黄素具有抑制小cums模型小鼠的抑郁行为的作用。
29.本技术提供的分离提纯的方法，通过不同浓度的乙醇水溶液进行梯度洗脱和半制备高效液相色谱法对提出的组分进行提纯的方法相互协作，分离提取的当药黄素不仅更具有专一性，同时提高了提取的当药黄素的生物活性，有利于进行当药黄素的生物活性的研究。
30.具体的，本说明书一个或多个实施例提供了一种从菥蓂籽中提取当药黄素的方法，包括如下步骤：
31.粉碎：将菥蓂籽在60℃的烘箱中烘干，然后用粉碎机粉粹，过80目筛，得到菥蓂籽粉末；
32.脱脂：取干燥菥蓂籽粉末用滤纸包好，置于索氏提取器中，加入石油醚热回流脱脂3h后低温挥干，得到的粉料同法再脱脂两次，菥蓂籽脱脂粉料；
33.提取及初富集：用乙醇对菥蓂籽脱脂粉料进行微波加热回流提取，微波功率420w，微波时间156s，料液比1:14，乙醇浓度54％，然后收集水相进行旋转蒸发，并用正丁醇萃取富集，对提取液减压旋转蒸发至浸膏；
34.分离：将上述浸膏复溶于水中，上ab-8大孔树脂柱，用20％、30％、50％和70％乙醇-水洗脱液梯度洗脱，每种洗脱液用量10bv，流速为5ml/min，收集流出液，减压旋蒸去乙醇，冷冻干燥，分别获得组分组分ⅰ、组分ⅱ、组分iii和组分ⅳ；
35.纯化：取组分组分ii，用甲醇溶解,上半制备高效液相色谱法(semi-preparative hplc)制备当药黄素。
36.色谱柱：c18制备色谱柱(250mm
×
10mm
×
5μm)。流动相：乙腈(a)和0.1％磷酸-水(b)。梯度洗脱程序为：0-5min，10-17％a；5-10min，17-19％a；10-25min，19-26％a；25-26min，26-10％a；26-28min，10-10％a。柱温25℃，2707自动进样器进样填满定量环(100μl)。波长为335nm。pda检测器检测并手动收集流出物。添加0.1％的磷酸水溶液至流动相中以减少峰拖尾并改善峰形，然后减压旋转蒸发冻干，得到当药黄素。
37.经hplc检测，含量97.95％，经uv、ir、ms、2hnmr、
13
cnmr等表征其物理性状的数据与现有技术相一致。
38.采用慢性不可预知性温和刺激(cums)建立抑郁小鼠模型，通过悬尾实验、迫泳实验来评价当药黄素对cums模型小鼠的抗抑郁活性。
39.昆明小鼠60只，spf级，雌雄各半，20
±
2g，由哈尔滨医科大学动物实验部提供，许可证编号scxk(黑)2019-001。饲养温度为25
±
1℃，光照12h昼夜循环，自由摄食摄水，实验前适应性饲养一周。
40.spf级昆明小鼠共60只，雌雄各半，20
±
2g，将小鼠适应性喂养7d后进行分组，将雌雄各分为6组，分别为：正常对照组、抑郁模型对照组、盐酸氟西汀组(百忧解片剂315.0
±
0.4mg，每片含盐酸氟西汀20.0mg，小鼠给药百忧解20mg
·
kg-1
即盐酸氟西汀1.3mg
·
kg-1
)、当药黄素大、中、小剂量(分别为4mg
·
kg-1
、2mg
·
kg-1
、1mg
·
kg-1
)组，每组5只，正常对照组和阳性对照组灌胃蒸馏水，连续给药21天。
41.除正常对照组外，交替给予每组小鼠以下刺激21天：昼夜颠倒、夹尾2min、鼠笼倾斜30
°
12h、禁食24h、禁水24h、悬尾6min、潮湿垫料(100g垫料200ml水)12h、45℃热刺激6min、5℃冷刺激6min、强迫游泳(水温25℃)6min等。同一种刺激不得连续使用，防止小鼠产生适应性。
42.小鼠悬尾实验：造模给药21d后，将小鼠尾端1cm处用医用胶布悬挂于实验装置上，装置两侧及背部使用黑色的背景板，确保装置将小鼠悬挂后，实验动物鼻尖与桌面距离在20cm左右，将小鼠放置在装置中间位置，致使小鼠倒置空中时无所攀抓。小鼠为克服不正常体位试图通过挣扎而恢复正常体位，经一段时间后间断性不动放弃挣扎而呈现绝望状态。实验时长6min，记录小鼠后4min悬尾不动的时长。
43.小鼠强迫游泳实验：造模给药21d后，将小鼠放置于高30cm、直径14cm、水深15cm(小鼠四爪不可触底)、水温25
±
1℃的透明容器中。小鼠因放弃挣扎而减少幅度活动和活动时间，所谓不动是指小鼠在水中停止挣扎，或呈现漂浮状态，或有细小的肢体运动以保持头部浮在水面。实验时长6min，记录后4min小鼠游泳不动时间。
44.表1当药黄素对小鼠悬尾和强迫游泳不动时间的影响
[0045][0046]
与正常对照组雄比较:
a p＜0.05，
aa
p＜0.01，
aaa p＜0.001；与抑郁模型雄组比较:
b p＜0.05，
bb p＜0.01，
bbb p＜0.001。
[0047]
与正常对照组雌比较:
a p＜0.05，
aa
p＜0.01，
aaa p＜0.001；与抑郁模型雌组比较:
b p＜0.05，
bb p＜0.01，
bbb p＜0.001。
[0048]
结果如表1所示，抑郁模型小鼠的悬尾和强迫游泳不动时均与正常对照组有显著差异(p＜0.05)，证明造模成功。
[0049]
从结果可以看出，与抑郁模型组比较，各给药组均缩短小鼠在悬尾实验及强迫游泳实验中的不动时间。除当药黄素低剂量雌组和高剂量组外，其余各实验组p＜0.05，均有统计学意义。
[0050]
通过悬尾不动时间统计，分别与抑郁模型雄、雌组相比，当药黄素低剂量、中剂量雄组、可显著缩短悬尾小鼠的不动时间(p＜0.05)；当药黄素低剂量、中剂量、高剂量雌组均可显著缩短悬尾小鼠的不动时间(p＜0.05)。
[0051]
通过强迫游泳不动时间统计，与分别于抑郁模型雄、雌组相比，当药黄素中剂量雄组可显著缩短强迫游泳小鼠不动时间(p＜0.05)，当药黄素低剂量雄组可较显著缩短强迫游泳小鼠不动时间(p＜0.01)；当药黄素中剂量雌组可显著缩短强迫游泳小鼠不动时间(p＜0.05)。
[0052]
上述实验结果表明，当药黄素对cums抑郁模型小鼠的发病过程有保护作用。其中低剂量的当药黄素对雄鼠药效较强，中剂量的当药黄素对雌鼠的药效较强。
[0053]
本说明书一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。