yeats2 yeats结构域抑制剂作为新型抗癌剂的发现
1.相关申请的交叉引用
2.本技术要求于2022年3月17日提交的美国临时申请序列no.63/269,511的权益，该临时申请据此全文(包括任何表、附图、或图示)以引用方式并入。
背景技术：
3.组蛋白翻译后修饰(ptm)，如赖氨酸乙酰化、精氨酸甲基化和丝氨酸磷酸化，在一些生物过程中发挥着关键作用。通过中和组蛋白残基(赖氨酸或精氨酸)的正电荷，组蛋白ptm干扰修饰位点周围的物理化学环境。这些ptm由“写入者”和“擦除者”修饰，并且也充当停泊位点以使特异性蛋白质(“读取者”)募集到染色质，从而向下游细胞事件(如基因表达、dna复制和损伤修复)发信号。鉴于这些与必需细胞过程的众多联系，组蛋白ptm的异常“读取”与人类疾病(如癌症)密切相关联。因此，组蛋白ptm“读取者”被认为是药物发现的具前景性的靶标。
4.最近，yeats结构域被鉴定为组蛋白乙酰化(如组蛋白赖氨酸乙酰化(kac)和赖氨酸巴豆酰化(kcr))的新型“读取者”。人类基因组编码4种含有yeats结构域的蛋白质(ycp)，包括af9、enl、yeats2和gas41，它们是染色质修饰和转录复合体的关键成员，参与染色质重塑和转录调控。在支持它们的功能重要性方面，这些yeats家族蛋白的失调通常与人类疾病有关。
5.yeats2是在人类癌症(包括nsclc、胰腺癌和卵巢癌)中高度扩增的新兴致癌基因。据报道，yeats2的缺失可降低nsclc细胞(a549和h1299)的生长和转化活性，表明其对于细胞存活不可或缺的作用(参见mi,w.,guan,h.,lyu,j.等人,yeats2 links histone acetylation to tumorigenesis of non-small cell lung cancer.nat commun 8,1088(2017))。yeats2的yeats结构域通过与其两个芳香残基(y262和w282)形成独特的-π-π-π堆积来识别组蛋白赖氨酸乙酰化。y262a或w282a突变可破坏yeats2与组蛋白赖氨酸乙酰化之间的相互作用。当将野生型yeats2重新引入yeats2缺失的nsclc细胞时，细胞增殖恢复，而突变型(含有y262a和w282a)yeats2则没有。因此，yeats2 yeats结构域作为治疗nsclc的有吸引力的治疗靶标出现。然而，迄今为止，尚未开发出yeats2 yeats抑制剂。
6.因此，仍然需要yeats2 yeats的抑制剂。
技术实现要素：
7.本发明涉及新型yeats2 yeats抑制剂和使用所述抑制剂的方法。在某些实施方案中，抑制剂可以经由独特的“夹心”笼来靶向yeats2 yeats。抑制剂可占据yeats2 yeats的kac结合口袋，它是由残基y262和w282构成的芳香笼。抑制剂的乙酰基可嵌入y262与w282的两个芳香环之间，以形成独特的“夹心”笼。在某些实施方案中，抑制剂hc25b和hc26b可有效地抑制yeats2 yeats以及细胞生长和细胞增殖。在某些实施方案中，yeats2 yeats结构域优先识别芳香“夹心”笼中的h3k27ac。在某些实施方案中，yeats2 yeats抑制剂可用于治疗受试者的癌症。在某些实施方案中，yeats2通过读取组蛋白乙酰化而与非小细胞肺癌
(nsclc)的肿瘤发生相关；因此，yeats2 yeats抑制剂可用于治疗nsclc。
8.在某些实施方案中，肽衍生的抑制剂具有89纳摩尔的最高亲和力，靶向yeats2 yeats结构域的kbz结合区的独特π-π-π堆积相互作用。在某些实施方案中，抑制剂例如ls-1-124(式(ii))可有效地减少yeats2相关复合体的染色质占据，下调致癌基因，并且/或者阻断nsclc细胞增殖。
附图说明
9.图1a-1e.(图1a).标记yeats2的光亲和探针h3k27bz-dzyne的结构。(图1b).展示竞争性光交联以评价抑制剂效力的示意图。(图1c).photo-h3k27cr与photo-h3k27bz之间标记效率的比较。(图1d-1e).通过竞争性光交联测定确定的h3k27cr和h3k27bz的ic
50
曲线。
10.图2a-2c.(图2a).衍生自h3
22-32
k27cr的开发肽的化学结构；(图2b)三点竞争性光交联测定以粗略地估计在h3k27处具有不同修饰的肽抑制剂的抑制活性，探针是h3k27bz-dzyne。(图2c)显示肽的抑制效应的柱状图。荧光强度数据由(图2b)中所显示的凝胶定量。
11.图3a-3c.(图3a).yeats2和h3k27bz的晶体结构。(图3b-3c).通过光交联竞争测定得到的抑制剂对yeats2 yeats的抑制效应的ic
50
比较。
12.图4a-4d.(图4a)通过竞争性光交联测定的三点筛选。(图4b)4-1至4-19的结构。(图4c)苯并呋喃衍生物的结构。(图4d)显示肽(ca1-ca39)的抑制效应的热图，由凝胶定量荧光强度(％)数据。
13.图5a-5i.(图5a、5d和5g)photo-h3k27bf的结构；(图5b-5c、5e-5f和5h-5i)测量抑制剂的ic
50
的光交联竞争测定。
14.图6a-6h.yeats2 yeats对h3k27cr(图6b)、h3k27bz(图6c)、h3k27bf(图6d)、ack
bf
sap(图6e)、msk
bf
sap(图6f)、msk
cl-bf
sap(图6g)和msk
br-bf
sap(图6h)的结合亲和力的itc测定。
15.图7a-7d.(图7a)显示msk
bf
sap靶向h1299细胞中的内源性yeats2的cetsa；frap测定中的frap曲线(图7b)和恢复t
1/2
(图7c)。比例尺＝4μm。数据报告为平均值
±
s.e.m.，n≥20。p值基于双尾学生t检验。**p《0.01，****p《0.0001；(图7d)用抑制剂处理的h1299细胞中yeats2富集基因的chip-qpcr分析。
16.图8a-8b.(图8a)采用或不采用抑制剂处理的a549的集落形成测定；(图8b)(图8a)的集落数。
17.图9a-9g.通过竞争性光交联测定确定的hc24b、hc25b和hc26b的ic
50
。
18.图10a-10c.发光atp检测系统显示在与抑制剂一起孵育后h1299(图10a)和a549(图10b)中的存活率(％)；(图10c)采用或不采用抑制剂处理的a549的集落形成测定。
19.图11a-11b.图11a提供了通过竞争性光交联测定得到的含n-甲基ala和ser的抑制剂对yeats2 yeats的抑制活性的比较；图11b提供了通过竞争性光交联测定得到的在c末端偶联的六和七元环对yeats2 yeats的效力的比较。
20.图12a-12b.图12a显示了发光atp检测系统显示在用抑制剂处理后h1299和a549的存活率(％)；图12b显示了采用或不采用抑制剂处理的h1299和a549的集落形成测定。
21.图13a-13b.使用串联-yeats2 yeats的frap测定(图13a)以及frap曲线和恢复t
1/2
(图13b)。比例尺＝4μm。数据报告为平均值
±
s.e.m.，n≥20。p值基于双尾学生t检验(*p《
0.05，**p《0.01，***《0.001，****p《0.0001，n.s.：不显著)。
22.图14a-14b.与内源性af9接合的ls-1-124。图14a显示用于标记yeats2的探针1的结构；(图14b)显示在存在或不存在ls-1-124的情况下采用探针1在全细胞裂解液(2mg/ml)中的光交联下拉。
23.图15a-15d.(图15a)肿瘤生长曲线图；(图15b)小鼠体重曲线图；(图15c)如(图15a)中经皮下移植到免疫缺陷裸鼠中的h1299细胞的肿瘤体积。通过配对学生t检验进行统计学评价(平均值
±
s.e.m.)。(图15d)用dmso或ls-1-124处理26天后肿瘤的h&e染色(上图)；用dmso或ls-1-124处理26天后肿瘤组织的ki-67免疫组织化学染色的代表性图像(下图)。
具体实施方式
24.所选的定义
25.如本文所用，单数形式“一个”、“一种”和“所述”也旨在包括复数形式，除非上下文另外明确指出。此外，就在具体实施方式和/或权利要求书中使用的术语“包括(including)”、“包括(includes)”、“具有(having)”、“具有(has)”、“含”、或它们的变体而言，这些术语旨在以类似于术语“包含”的方式包括在内。过渡术语/短语(及其任何语法变体)“包含(comprising)”、“包含(comprises)”，“包含(comprise)”、“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”、“基本上由
……
组成(consists essentially of)”、“由
……
组成(consisting)”和“由
……
组成(consists)”可以互换使用。
26.短语“基本上由
……
组成(consisting essentially of)”或“基本上由
……
组成(consists essentially of)”指示权利要求涵盖含有指定材料或步骤以及不实质上影响权利要求的一个或多个基本和新颖特征的那些的实施方案。
27.术语“约”意指处在如由本领域的普通技术人员所确定的特定值的可接受误差范围内，其部分地取决于该值如何测量，即测量系统的限制。在其中使用术语“约”的含有一定量的成分的组合物的语境中，这些组合物含有在该值的附近变化0-10％(误差范围)的所陈述量(x
±
10％)的成分。在其它语境中，术语“约”提供在给定值附近0-10％的变化(误差范围)(x
±
10％)。显而易见的是，该变化代表高于或低于给定值多至10％的范围，例如x
±
1％、x
±
2％、x
±
3％、x
±
4％、x
±
5％、x
±
6％、x
±
7％、x
±
8％、x
±
9％、或x
±
10％。
28.在本公开中，范围以简写形式陈述以避免必须详细陈述并描述该范围内的每个和每一个值。在适当的情况下，可以选择该范围内的任何适当的值作为该范围的上限值、下限值、或终点。例如，0.1-1.0的范围表示0.1和1.0的端值，以及0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9的中间值，以及0.1-1.0内涵盖的所有中间范围，如0.2-0.5、0.2-0.8、0.7-1.0等。设想在一个范围内具有至少两个有效数字的值，例如，5-10的范围指示5.0与10.0之间以及5.00与10.00之间的所有值，包括端值。当在本文中使用范围时，范围的组合和子组合(例如，所公开范围内的子范围)和其中的具体实施方案明确地包括在内。
29.如本文所用，术语“受试者”是指需要或希望递送治疗性化合物所提供的有益效果的动物。动物可为例如人、猪、马、山羊、猫、小鼠、大鼠、狗、类人猿、鱼、黑猩猩、猩猩、豚鼠、仓鼠、牛、绵羊、鸟、鸡，以及任何其它脊椎动物或无脊椎动物。这些有益效果可包括但不限于治疗健康状况、疾病或障碍；预防健康状况、疾病或障碍；免疫健康；增强体内器官、组织、
或系统的功能。在本发明上下文中，优选的受试者是人。受试者可为任何年龄或发育阶段，包括婴儿、幼儿、青少儿、青少年、成人、或老年人。
30.如本文所用，术语“治疗有效量”、“治疗有效剂量”、“有效量”和“有效剂量”用于指当向受试者施用时，能够治疗或改善受试者的病症、疾病、或障碍，或者能够增强器官、组织、或身体系统健康状况或功能的化合物或组合物的量或剂量。换句话讲，当向受试者施用时，该量是“治疗有效的”。实际量将取决于许多因素而变化，包括但不限于所治疗或改善的特定病症、疾病、或障碍；病症的严重程度；期望增强健康状况或功能的特定器官、组织、或身体系统；患者的体重、身高、年龄和健康状况；以及施用途径。
31.如本文所用，术语“治疗”是指在任何程度上根除、减少、改善、或逆转健康状况、疾病、或障碍的体征或症状，并且包括但不要求完全治愈状况、疾病或障碍。治疗可以是治愈、改良、或部分改善障碍。“治疗”还可以包括改良或增强状况或特征，例如，使身体中特定系统的功能达到更高的健康或稳态状态。
32.如本文所用，“预防”健康状况、疾病、或障碍是指避免、延迟、预先阻止、或最小化该状况、疾病、或障碍的特定体征或症状的发作。预防可以但不需要是绝对或完全的；意味着体征或症状仍然可能在日后发展。预防可以包括降低这种状况、疾病、或障碍发作的严重程度，并且/或者抑制状况、疾病、或障碍进展为更严重的状况、疾病、或障碍。
33.在本发明的一些实施方案中，该方法包括施用多剂量的本发明化合物。该方法可包括施用1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40个或更多个治疗有效剂量的包含如本文所述的本发明化合物的组合物。在一些实施方案中，在1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、10天、14天、21天、30天、或超过30天的过程中施用剂量。此外，用治疗有效量的本发明化合物治疗受试者可包括单次治疗，或者可包括一系列治疗。还应理解，用于治疗的化合物的有效剂量可以在特定治疗过程中增加或减少。剂量的变化可以根据本领域已知的用于检测肿瘤尺寸的诊断测定或成像技术的结果而产生并且变得显而易见。在本发明的一些实施方案中，该方法包括每天若干次施用化合物，包括但不限于每天2次、每天3次和每天4次。
34.如本文所用，“分离的”或“纯化的”化合物基本上不含其它化合物。在某些实施方案中，纯化的化合物为至少60重量％(干重)的所关注化合物。优选地，制剂为至少75重量％，更优选地至少90重量％，并且最优选地至少99重量％的所关注化合物。例如，纯化的化合物为按重量计至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、98％、99％、或100％(w/w)的期望化合物的化合物。纯度通过任何合适的标准方法进行测量，例如通过柱色谱、薄层色谱、或高效液相色谱(hplc)分析。
35.所谓的“减少”意指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％、或100％的负变化。
36.所谓的“增大”意指至少1％、5％、10％、25％、50％、75％、或100％的正变化。
37.如本文所用，“药物”是指被制造用作医疗和/或治疗药物的化合物。
38.如本文所用，“蛋白质读取者”或“读取者”是可被募集至染色质上的翻译后修饰位点以向下游细胞事件(如基因表达、dna复制和损伤修复)发信号的特异性蛋白质。
39.本文中变量的任何定义中化学基团列表的表述包括该变量作为任何单个基团或所列基团的组合的定义。本文中变量或方面的实施方案的表述包括作为任何单个实施方案或与任何其它实施方案的组合或其部分的实施方案。
40.本文所提供的任何组合物或方法可以与本文所提供的任何其它组合物和方法中
的一种或多种组合。
41.yeats2 yeat结构域抑制剂组合物的制备
42.在某些实施方案中，yeats2 yeat抑制剂组合物为式(i)的yeats2yeat结构域抑制剂、或包含所述yeats2 yeat结构域抑制剂的组合物。在某些实施方案中，治疗性化合物可为式(ii)和(iii)的hc25b和hc26b。
43.式(i)
[0044][0045]
其中r选自
[0046][0047]
式(ii)
[0048][0049]
式(iii)
[0050][0051]
在某些实施方案中，yeats2 yeat抑制剂组合物为式(iv)、式(v)、式(vi)、式(vii)、式(viii)、式(ix)、式(x)、式(xi)、式(xii)、式(xiii)、式(xiv)、式(xv)、式(xvi)、式(xvii)、式(xviii)、式(xix)、式(xx)、式(xxi)、式(xxii)、式(xxiii)、式(xxiv)、式(xxv)、式(xxvi)、式(xxvii)、式(xxviii)、式(xxix)、式(xxx)、式(xxxi)、式(xxxii)、式(xxxiii)、式(xxxiv)、式(xxxv)、式(xxxvi)、式(xxxvii)、式(xxxviii)、式(xxxix)、式(xl)、式(xli)、式(xlii)、式(xliii)、式(xliv)、式(xlv)、式(xlvi)、式(xlvii)、式(xlviii)、式(xlix)、式(l)、式(li)、式(liii)、式(liv)、式(lv)、式(lvi)、式(lvii)、式(lviii)、或式(lix)、式(lx)、式(lxi)的yeats2 yeat结构域抑制剂或包含所述yeats2 yeat结构域抑制剂的组合物。在某些实施方案中，抑制剂可包含一种或多种氨基酸或肽。
[0052]
式(iv)
[0053][0054]
其中r选自：
[0055][0056]
式(v)
[0057][0058]
其中r选自
[0059]
[0060][0061]
式(vi)
[0062][0063]
式(vii)
[0064][0065]
式(viii)
[0066][0067]
式(ix)
[0068][0069]
式(x)
[0070][0071]
其中r选自
[0072][0073]
式(xi)
[0074][0075]
其中r1选自：
[0076]
式(xii)
[0077]
[0078]
其中r2选自
[0079]
式(xiii)
[0080][0081]
其中r3选自：
[0082]
式(xiv)
[0083][0084]
其中r4选自：
[0085][0086]
式(xv)
[0087][0088]
式(xvi)
[0089][0090]
式(xvii)
[0091][0092]
式(xviii)
[0093][0094]
式(xix)
[0095][0096]
其中r选自
[0097][0098]
式(xx)
[0099][0100]
其中r1选自
[0101][0102]
并且y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0103]
式(xxi)
[0104][0105]
其中r2选自
[0106][0107]
并且y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0108]
式(xxii)
[0109][0110]
其中r3选自
[0111][0112]
并且y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0113]
式(xxiii)
[0114][0115]
其中r4选自
[0116][0117]
并且y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0118]
式(xxiv)
[0119][0120]
其中y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0121]
式(xxv)
[0122][0123]
其中y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0124]
式(xxvi)
[0125][0126]
其中y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0127]
式(xxvii)
[0128][0129]
其中y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0130]
式(xxviii)
[0131][0132]
其中y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0133]
式(xxix)
[0134][0135]
其中y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道，
[0136]
式(xxx)
[0137][0138]
其中r1选自
[0139][0140]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0141]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0142]
式(xxxi)
[0143][0144]
其中r2选自
[0145][0146]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0147]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0148]
式(xxxii)
[0149][0150]
其中r3选自
[0151][0152]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0153]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0154]
式(xxxiii)
[0155]
[0156]
其中r4选自
[0157][0158]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0159]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0160]
式(xxxiv)
[0161][0162]
其中x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0163]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0164]
式(xxxv)
[0165][0166]
其中x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0167]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0168]
式(xxxvi)
[0169][0170]
其中x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0171]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0172]
式(xxxvii)
[0173][0174]
其中x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0175]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0176]
式(xxxviii)
[0177][0178]
其中x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0179]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0180]
式(xxxix)
[0181][0182]
其中x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；并且
[0183]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子的p轨道，
[0184]
式(xl)
[0185][0186]
其中r2选自
[0187][0188]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0189]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0190]
z选自ch2、o、nh、s、n-me；并且
[0191]
m和n各自独立地为0至8的整数，其中m或n中的至少一个不为0，式(xli)
[0192][0193]
其中r3选自
[0194][0195]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0196]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0197]
z选自ch2、o、nh、s、n-me；并且
[0198]
m和n各自独立地为0至8的整数，其中m或n中的至少一个不为0，式(xlii)
[0199][0200]
其中r4选自
[0201][0202]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0203]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0204]
z选自ch2、o、nh、s、n-me；并且
[0205]
m和n各自独立地为0至8的整数，其中m或n中的至少一个不为0；式(xliii)
[0206][0207]
其中r1选自
[0208][0209]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0210]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0211]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0212]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；并且
[0213]
r5选自h、me、et、pr、或ipr，
[0214]
式(xliv)
[0215][0216]
其中r2选自
[0217][0218]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0219]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0220]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0221]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；并且
[0222]
r5选自h、me、et、pr、或ipr，
[0223]
式(xlv)
[0224][0225]
其中r3选自
[0226][0227]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0228]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0229]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0230]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；并且
[0231]
r5选自h、me、et、pr、或ipr，
[0232]
式(xlvi)
[0233][0234]
其中r4选自
[0235][0236]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0237]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0238]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0239]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；并且
[0240]
r5选自h、me、et、pr、或ipr，
[0241]
式(xlvii)
[0242][0243]
其中r1选自
[0244][0245]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0246]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0247]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0248]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；
[0249]
r5选自h、me、et、pr、或ipr；并且
[0250]
r6选自h、me、et、pr、或ipr，
[0251]
式(xlviii)
[0252][0253]
其中r2选自
[0254][0255]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0256]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0257]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0258]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；
[0259]
r5选自h、me、et、pr、或ipr；并且
[0260]
r6选自h、me、et、pr、或ipr，
[0261]
式(xlix)
[0262][0263]
其中r3选自
[0264][0265]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0266]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0267]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0268]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；
[0269]
r5选自h、me、et、pr、或ipr；并且
[0270]
r6选自h、me、et、pr、或ipr，
[0271]
式(l)
[0272][0273]
其中r4选自
[0274][0275]
x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0276]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0277]
m和n各自独立地为0至10的整数；
[0278]
z选自ch2、o、nh、s、c＝o、n；
[0279]
r5选自h、me、et、pr、或ipr；并且
[0280]
r6选自h、me、et、pr、或ipr，
[0281]
式(li)
[0282][0283]
其中x选自nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0284]
y选自包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0285]
j1和j2独立地为任何α氨基酸；并且
[0286]
m和n各自独立地为0至10的整数，其中m或n中的至少一个不为0。
[0287]
式(liii)
[0288][0289]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0290]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0291]
m和n各自独立地为0至8的整数，其中m或n中的至少一个不为0；并且
[0292]
z为ch2、o、nh、s、n-me，
[0293][0294]
式(liv)
[0295][0296]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0297]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0298]
m和n各自独立地为0至8的整数，其中m或n中的至少一个不为0；并且
[0299]
z为ch2、o、nh、s、n-me，
[0300][0301]
式(lv)
[0302][0303]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0304]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0305]
m和n各自独立地为0至8的整数，其中m或n中的至少一个不为0；并且
[0306]
z为ch2、o、nh、s、n-me，
[0307][0308]
式(lvi)
[0309][0310]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0311]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0312]
m和n各自独立地为0-10的整数；
[0313]
z为ch2、o、nh、s、c＝o、n；并且
[0314]
r5为h、me、et、pr、或ipr，
[0315][0316]
式(lvii)
[0317][0318]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0319]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0320]
m和n各自独立地为0-10的整数；
[0321]
z为ch2、o、nh、s、c＝o、n；并且
[0322]
r5为h、me、et、pr、或ipr，
[0323][0324]
式(lviii)
[0325][0326]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0327]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0328]
m和n各自独立地为0-10的整数；
[0329]
z为ch2、o、nh、s、c＝o、n；并且
[0330]
r5为h、me、et、pr、或ipr，
[0331][0332]
式(lix)
[0333][0334]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0335]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0336]
m和n各自独立地为0-10的整数；
[0337]
z为ch2、o、nh、s、c＝o、n；
[0338]
r5为h、me、et、pr、或ipr；并且
[0339]
r6为h、me、et、pr、或ipr，
[0340][0341]
式(lx)
[0342][0343]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0344]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0345]
m和n各自独立地为0-10的整数；
[0346]
z为ch2、o、nh、s、c＝o、n；
[0347]
r5为h、me、et、pr、或ipr；并且
[0348]
r6为h、me、et、pr、或ipr，
[0349][0350]
式(lxi)
[0351][0352]
其中x为nh-c＝o、nh-c＝s、o-c＝o、c＝o-o、nh-so2；
[0353]
y为包含未取代或取代的芳香环(单环、双环、三环、四环)、未取代或取代的烯基或炔基的共轭/离域基团，其中共轭/离域基团包含允许π电子变得离域的p轨道；
[0354]
m和n各自独立地为0-10的整数；
[0355]
z为ch2、o、nh、s、c＝o、n；
[0356]
r5为h、me、et、pr、或ipr；并且
[0357]
r6为h、me、et、pr、或ipr，
[0358][0359]
在优选的实施方案中，根据本发明的组合物和方法利用yeats2 yeat抑制剂，例如根据式(i)的抑制剂。可将yeats2 yeat结构域抑制剂化合物以按重量计0.01至50％(重量％)，优选地0.1至20重量％，并且更优选地0.1至10重量％的浓度添加到组合物中。在某些实施方案中，可将yeats2 yeat抑制剂以约1mg/kg至约200mg/kg的剂量施用于受试者。
[0360]
在一个实施方案中，将本发明组合物配制成可口服消耗产品，例如食物类、胶囊、丸剂、或可饮用液体。可口服递送药物是经由在胃肠道中或口腔粘膜中的初始吸收而递送的任何生理活性物质。还可将本发明组合物配制成能够经由例如注射(其包括静脉内、腹膜内、肌内、鞘内、或皮下)施用的溶液剂。在其它实施方案中，将本发明组合物配制成通过贴剂经由皮肤施用，或者直接施用到皮肤上以供局部或全身效应。组合物可以经舌下、口服、直肠、或阴道施用。此外，可将组合物喷雾到鼻中以通过鼻粘膜吸收，雾化、经由口或鼻吸入，或者在眼或耳中施用。
[0361]
根据本发明的可口服消耗产品是适于消耗、营养学、口腔卫生、或愉悦的任何制剂或组合物，并且是旨在引入人或动物口腔中、在该处保留特定时间段，并然后吞咽(例如，即可食用的食物或丸剂)或再次从口腔中移除(例如，口香糖或口腔卫生产品或医用漱口水)的产品。虽然可口服递送药物可配制成可口服消耗产品，并且可口服消耗产品可包含可口服递送药物，但是这两个术语并不意味着可在本文中互换使用。
[0362]
可口服消耗产品包括旨在以加工、半加工、或未加工状态被人或动物摄取的所有物质或产品。这还包括在其生产、处理、或加工期间添加到可口服消耗产品(特别是食品和药品)中并旨在引入人或动物口腔中的物质。
[0363]
可口服消耗产品还可包括旨在被人或动物吞咽并然后以未经改性的、制备的、或加工的状态消化的物质；因此，根据本发明的可口服消耗产品还包括旨在与产品一起吞咽或预期吞咽的肠衣、包衣、或其它包囊。
[0364]
在一个实施方案中，可口服消耗产品是含有期望的可口服递送物质的胶囊剂、丸剂、糖浆剂、乳剂、或液体混悬剂。在一个实施方案中，可口服消耗产品可包含粉末形式的可口服递送物质，其可以与水或另一种液体混合以产生可饮用的可口服消耗产品。
[0365]
在一些实施方案中，本发明的可口服消耗产品可包含一种或多种旨在用于营养或愉悦的制剂。这些特别包括焙烤制品(例如，面包、干制饼干、蛋糕和其它甜点)、甜食(例如，巧克力、巧克力棒产品、其它棒产品、果味橡皮糖、包衣片剂、硬块焦糖、太妃糖和焦糖，以及口香糖)、酒精或非酒精饮料(例如，可可、咖啡、绿茶、红茶、富含绿茶或红茶提取物的红茶或绿茶饮料、南非博士茶(rooibos tea)、其它草药茶、含水果的柠檬水、等渗饮料、软饮料、果肉饮料、水果和蔬菜汁，以及水果或蔬菜汁制备品)、速溶饮料(例如，速溶可可饮料、速溶茶饮料和速溶咖啡饮料)、肉制品(例如，火腿、新鲜或生香肠制备品，以及调味或盐卤鲜肉或者腌制肉制品)、蛋或蛋制品(例如，干全蛋、蛋清和蛋黄)、谷物制品(例如，早餐谷物、燕麦坚果能量棒和预制速溶米制品)、乳制品(例如，全脂或减脂或脱脂乳饮料、八宝饭、酸奶、牛奶酒、奶油干酪、软干酪、硬干酪、干奶粉、乳清、黄油、酪乳，以及部分或全部水解的含有乳蛋白的产品)、来自大豆蛋白或其它大豆级分的产品(例如，豆乳及其制备的产品、含有分离或酶处理的大豆蛋白的饮料、含有大豆粉的饮料、含有大豆卵磷脂的制备品、发酵制品如豆腐或其制备的豆豉制品，以及与水果制备品和任选的调味物质的混合物)、水果制备品(例如，果酱、鲜果冰淇淋、水果沙司和水果馅)、蔬菜制备品(例如，番茄酱、沙司、脱水蔬菜、深冻蔬菜、预制蔬菜和白灼蔬菜)、点心制品(例如，烘焙或油炸土豆片(各式洋芋片)或基于玉米或花生的马铃薯面团制品和挤出品)、基于脂肪和油或其乳剂的产品(例如，蛋黄酱、调味蛋黄酱和调味品)、其它现成的膳食和汤(例如，干粉汤、速溶汤和预制汤)、调味料(例如撒上的调味料)、甜味剂组合物(例如，片剂、小药囊，以及用于增甜或增白饮料或其它食品
的其它制备品)。本发明的组合物还可以充当用于生产旨在营养或愉悦的其它组合物的半成品。
[0366]
本发明组合物还可包含一种或多种药学上可接受的载体和/或赋形剂，并且可配制成例如固体、半固体、液体、或气体形式的制剂，如片剂、胶囊剂、散剂、颗粒剂、软膏剂、溶液剂、栓剂、注射剂、吸入剂和气雾剂。
[0367]
如本文所用，术语“药学上可接受的”意指与药物组合物的其它成分相容并且对其接受者无害。
[0368]
根据本发明的载体和/或赋形剂可包括任何和所有溶剂、稀释剂、缓冲剂(例如，中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水、或任选地tris-hcl、乙酸盐或磷酸盐缓冲剂)、水包油或油包水乳液、包含或不包含适于例如iv使用的有机共溶剂的水性组合物、增溶剂(例如，聚山梨醇酯65、聚山梨醇酯80)、胶体、分散介质、载体、填充剂、螯合剂(例如，edta或谷胱甘肽)、氨基酸(例如甘氨酸)、蛋白质、崩解剂、粘合剂、润滑剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、芳香剂、增稠剂(例如，卡波姆、明胶、或海藻酸钠)、包衣剂、防腐剂(例如，硫柳汞、苄醇、聚季铵盐)、抗氧化剂(例如，抗坏血酸、焦亚硫酸钠)、张力控制剂、吸收延迟剂、佐剂、增量剂(例如，乳糖、甘露糖醇)等。载体和/或赋形剂在药物和补充剂领域中的用途是公知的。除了与目标健康促进物质或与组合物不相容的任何常规介质或试剂之外，还可以考虑在本发明组合物中使用载体或赋形剂。
[0369]
在一个实施方案中，可将本发明的组合物制成气雾剂制剂，使得例如其可雾化或吸入。适于以气雾剂或喷剂形式施用的药物制剂为例如散剂、颗粒、溶液剂、混悬剂或乳剂。用于口或鼻用气雾剂或吸入施用的制剂也可以与载体(包括例如盐水、聚乙二醇或二醇类、dppc、甲基纤维素)一起配制，或者与粉末状分散剂或碳氟化合物混合配制。可将气雾剂制剂置于加压抛射剂如二氯二氟甲烷、丙烷、氮气、氟碳化合物，和/或本领域已知的其它增溶剂或分散剂中。示例性地，递送可以通过使用一次性递送装置、雾喷雾器、呼吸激活的粉末吸入器、气雾剂定量吸入器(mdi)、或本领域中可用的众多喷雾器递送装置中的任何其它者。另外，也可以使用喷雾帐篷或通过气管内导管直接施用。
[0370]
在一个实施方案中，本发明的组合物可以配制用于经由注射施用，例如作为溶液剂或混悬剂。溶液剂或混悬剂可包含合适的无毒胃肠外可接受的稀释剂或溶剂，如甘露糖醇、1,3-丁二醇、水、林格氏液、或等渗氯化钠溶液、或合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂，如无菌无刺激性固定油，包括合成甘油单酯或甘油二酯，以及脂肪酸，包括油酸。用于静脉内使用的载体的一个示例性实例包括10％ usp乙醇、40％ usp丙二醇或聚乙二醇600以及余量usp注射用水(wfi)的混合物。用于静脉内使用的其它示例性载体包括10％ usp乙醇和usp wfi；usp wfi中的0.01-0.1％三乙醇胺；或usp wfi中的0.01-0.2％二棕榈酰二磷脂酰胆碱；以及1-10％角鲨烯或胃肠外水包植物油乳液。水或盐水溶液以及右旋糖水溶液和甘油溶液可优选地用作特别是可注射溶液剂的载体。用于皮下或肌内使用的载体的示例性实例包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)溶液、wfi中的5％右旋糖以及usp wfi中的5％右旋糖或0.9％氯化钠中的0.01-0.1％三乙醇胺，或1比2或1比4的10％ usp乙醇、40％丙二醇以及余量可接受等渗溶液(如5％右旋糖或0.9％氯化钠)的混合物；或usp wfi中的0.01-0.2％二棕榈酰二磷脂酰胆碱以及1至10％角鲨烯或肠胃外水包植物油乳液。
[0371]
在一个实施方案中，本发明的组合物可以配制用于经由局部施用到皮肤上进行施
用，例如，作为局部组合物，其包括冲洗剂、喷剂、或滴剂、洗剂、凝胶剂、软膏剂、乳膏剂、泡沫剂、散剂、固体、海绵、胶布、蒸气剂、糊剂、酊剂，或者使用透皮贴剂。除任何药物活性载体之外，局部应用的合适制剂还可包含例如润肤剂如巴西棕榈蜡、鲸蜡醇、鲸蜡酯蜡、乳化蜡、含水羊毛脂、羊毛脂、羊毛脂醇、微晶蜡、石蜡、凡士林、聚乙二醇、硬脂酸、硬脂醇、白蜂蜡、或黄蜂蜡。另外，组合物可含有湿润剂如甘油、丙二醇、聚乙二醇、山梨糖醇溶液，以及1,2,6己三醇或渗透增强剂如乙醇、异丙醇、或油酸。
[0372]
在某些实施方案中，探针可结合yeats2蛋白。在某些实施方案中，探针根据式(lii)：
[0373]
式(lii)
[0374][0375]
使用本发明化合物的方法
[0376]
在某些实施方案中，可向受试者施用根据式(i)的yeats2 yeat抑制剂或其衍生物。本发明的方法中设想了可允许抑制剂与细胞接触的任何施用手段，包括例如口服、静脉内、腹膜内、肌内、鞘内、或皮下。
[0377]
在某些实施方案中，yeats2 yeat抑制剂可接触受试者的健康细胞和/或肿瘤细胞或癌细胞。在某些实施方案中，yeats2 yeat抑制剂可接触肺中的细胞，包括癌性肺细胞。在某些实施方案中，yeats2 yeat抑制剂可抑制非小细胞肺癌、胰腺癌、卵巢癌、肝癌，以及yeats2表达水平升高的其它实体瘤。yeats2 yeat抑制剂可渗透受试者的细胞，包括例如癌细胞。
[0378]
在某些实施方案中，yeats2 yeat抑制剂可靶向yeats2的赖氨酸乙酰化(kac)结合口袋。yeats2 yeats结构域抑制剂可通过占据赖氨酸乙酰化(kac)结合口袋来靶向yeats2。
[0379]
在某些实施方案中，yeats2 yeat抑制剂可识别表观遗传修饰。yeats2 yeats结构域抑制剂可通过靶向其结合口袋来破坏yeats2-h3k27ac相互作用。在某些实施方案中，可对组蛋白修饰，包括例如组蛋白的乙酰化。在优选的实施方案中，yeats2 yeat抑制剂可识别h3k27ac组蛋白修饰。
[0380]
材料和方法
[0381]
蛋白质表达和纯化
[0382]
使含有n末端10
×
his-sumo标签的yeats2
201-332
在大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)中过表达。在16℃下用0.4mm异丙基β-d-硫代半乳糖苷诱导过夜后，收集细胞并
悬浮于缓冲液中：20mm tris，ph 7.5，0.5m nacl，5％甘油，1mm苯甲基磺酰氟以及20mm咪唑。在细胞裂解和离心后，将重组蛋白经histrap纯化至同质，并使10xhis-sumo标签通过ulp1在4℃下裂解过夜，然后通过重新上样到histrap柱上移除。通过尺寸排阻色谱法，在superdex g75柱(ge healthcare,chicago,il)上如下洗脱缓冲液中最终精制游离yeats2
201
–
332
蛋白：20mm tris，ph 7.5，0.5m柠檬酸钠，5％甘油。
[0383]
光交联
[0384]
在不存在或存在不同浓度的竞争物的情况下，将探针与重组蛋白(5或20ng/μl)在结合缓冲液(50mm hepes，150mm nacl，2mm mgcl2，0.1％tween-20，20％甘油，ph 7.5，含有50ng/μl bsa)中于4℃下一起孵育10分钟。然后，在冰上的96孔中，使用uv灯在365nm下照射样品20分钟。cu(i)催化的叠氮化物-炔烃环加成(点击化学)
[0385]
向所制备的光交联样品中添加100μm罗丹明-n3用于胶内荧光(dmso中的10mm储备液)，继之以1mm tcep(新鲜制备的h2o中50mm储备液)和100μm tbta(dmso中的10mm储备液)；最终，通过添加1mm cuso4(新鲜制备的h2o中50mm储备液)引发反应。将反应在室温(22至25℃)和规则涡旋下孵育1小时。将反应通过添加5体积的冰冷丙酮猝灭，并在-20℃下放置过夜以沉淀蛋白质。
[0386]
胶内荧光扫描
[0387]
将蛋白质沉淀后的样品在4℃下以13,000
×
g离心5分钟。弃去上清液，并将沉淀用冰冷却的丙酮洗涤并风干10分钟。使蛋白质重悬于含有50mm dtt的1
×
lds上样缓冲液(invitrogen，waltham，ma)中并在95℃下加热8分钟。然后通过sds-page对样品进行解析。标记的蛋白质通过在typhoon9410可变模式成像仪(激发532nm，发射滤光片580nm)上扫描凝胶而可视化。
[0388]
等温滴定量热法测量
[0389]
在15℃下，在microcal itc200滴定量热计(microcal,northampton,ma)上在缓冲液(20mm tris，ph 7.5，0.5m柠檬酸钠，5％甘油)中执行实验。反应池含有280μl的30-100μm蛋白质，该蛋白质用相应的肽滴定(比所用的蛋白质浓度高十倍)。各滴定含有20次注射。对于每第一次注射，体积为0.4μl。对于其它注射，体积为2μl。使用单组独立位点，用origin 7.0软件包(originlab,northampton,ma)拟合结合等温线，以确定热力学解离常数和化学计量学。
[0390]
细胞热位移测定(cetsa)
[0391]
将h1299细胞以1
×
105个细胞/ml的密度接种在150mm培养皿中。第二天，将细胞用pbs洗涤，并与20μm msk
bf
sap或dmso在培养基中一起孵育16小时。然后，将细胞通过细胞刮刀分离并用pbs洗涤一次。将细胞沉淀重悬于含有1
×
roche完全无edta蛋白酶抑制剂的pbs中(大约50万个细胞/100μl)。然后，将细胞(100μl/pcr管)在veriti热循环仪(thermo fisher scientific,waltham,ma)中指定温度下加热3分钟，然后在室温下孵育3分钟。使样品经受两次冻融循环以裂解细胞。通过在4℃下以20,000
×
g离心30分钟使细胞裂解物澄清，并使所得的上清液经受免疫印迹分析。
[0392]
光漂白后荧光恢复(frap)
[0393]
将u2os细胞接种在nunc
tm
玻璃底皿(35mm，thermofisher)中，并使用effectene转染试剂(qiagen,hilden,germany)用质粒转染以表达af9-或enl-sfgfp融合蛋白。在转染期
间需要时添加伏立诺他(suberanilohydroxamic acid)(saha，2.5μm)，并在转染后24小时进行frap分析。就在frap之前，将培养基替换为补充有10％ fbs、25mm hepes和指定浓度的抑制剂的无酚红dmem培养基。将frap分析用联接到倒置zeiss axio observer.z1显微镜的carl zeiss lsm710 nlo执行，该显微镜配备有高数值孔径(na1.3)40
×
油浸物镜和设定于37℃的加热室。sfgfp荧光的漂白和成像采用氩离子激光(488nm，25mw，100％功率用于漂白，1％功率用于成像，针孔直径为3airy单位)进行，并将光电倍增管检测器设置成检测500至600nm的荧光。
[0394]
需要高增益装置用于成像的具有极低表达水平的sfgfp标记蛋白的细胞特别地对光漂白敏感，并且经常产生噪声图像，并因此被排除在frap分析的选择之外。具有极高表达水平的sfgfp标记蛋白的细胞通常表现出异常的形态，并且也被排除在frap分析的选择之外。因此，仅在650至800的增益范围内具有中等sfgfp荧光的细胞被选择用于frap分析。
[0395]
光漂白在面积尺寸为5mm2的圆形区域中执行。然后，获取延时系列以记录sfgfp荧光恢复。在12的比特深度、双向扫描、14的扫描速度以及14的缩放因子下，以512像素
×
512像素的帧尺寸获取延时图像，这允许大约0.15秒的时间间隔时间和0.5ms的像素停留时间。
[0396]
收集图像，并使用carl zeiss zen black软件定量选定区域的荧光强度。测量三个区域的荧光强度：1)漂白区域(f(t)
roi
)，2)未漂白区域(f(t)
ref
)和3)细胞外区域以确定背景信号(f(t)
bg
)。用公式1计算每个时间点(t)的漂白区域的相对荧光强度(f(t)
norm
)，其中f(i)是十次预漂扫描中区域的平均强度。
[0397][0398]
使用两相关联函数，将归一化数据拟合为双指数关联曲线，其具有式2所显示的式。
[0399]
y＝y0 a1(1-e-x/t1
) a2(1-e-x/t2
)
[0400]
公式2
[0401]
使用通过曲线拟合返回的参数，用公式3计算对应于半恢复的荧光强度。
[0402][0403]
当y＝y
1/2
时，然后使用迭代二分算法来确定公式2中t
1/2
(即荧光恢复一半的时间)的值。
[0404]
曲线拟合得到平台值》1或r2《0.95的细胞作为成像伪影从进一步分析中移除。
[0405]
染色质免疫沉淀和定量pcr(chip-qpcr)
[0406]
如先前所报道稍作修改来执行染色质免疫沉淀(erb ma,scott tg,li be,xie h,paulk j,seo hs,souza a,roberts jm,dastjerdi s,buckley dl,sanjana ne,shalem o,nabet b,zeid r,offei-addo nk,dhe-paganon s,zhang f,orkin sh,winter ge,bradner je.transcription control by the enl yeats domain in acute leukaemia.nature.2017年3月9日；543(7644):270-274.)。将hela细胞接种在150mm培养皿
上，大约60％汇合度。次日，将细胞用20μm msk
bf
sap或dmso处理24小时。然后，在室温下通过直接添加1/10体积的10
×
交联溶液(11％甲醛，50mm hepes ph 7.3，100mm nacl，1mm edta，0.5mm egta)使细胞交联10分钟，并添加0.125m甘氨酸以淬灭交联5分钟。然后，将细胞用pbs洗涤三次并重悬于冰冷的chip裂解缓冲液1(lb1；1ml/1千万个细胞；50mm hepes ph 7.3，140mm nacl，1mm edta，10％甘油，0.5％ np-40，0.25％ trition x-100，1
×
roche完全无edta蛋白酶抑制剂，roche,basel,switzerland)，并在4℃下旋转20分钟。在离心后，使沉淀重悬于冰冷的chip裂解缓冲液2(lb2；1ml/1千万个细胞；10mm tris-hcl ph 8.0，200mm nacl，1mm edta，0.5mm egta，1
×
roche完全无edta蛋白酶抑制剂)，并在4℃下旋转20分钟。在离心后，使沉淀悬浮于冰冷的超声处理缓冲液(0.3ml/1000万细胞；50mm hepes，ph 7.3，140mm nacl，1mm edta，1mm egta，1％ triton x-100，0.1％脱氧胆酸na，0.1％ sds，1
×
roche完全无edta蛋白酶抑制剂)。使用vcx750超声处理器(sonics&materials；2mm阶梯式超微针；30％振幅；打开1秒，关闭3秒，持续15分钟)，将样品超声处理至600bp至800bp范围内的染色质。然后，通过离心使染色质澄清。对于染色质定量，将澄清染色质的等分试样(约1/10体积)在95℃下反向交联20分钟并用0.2mg/ml rnase(thermo fisher scientific)在37℃下处理20分钟。将dna用qiaquick pcr纯化试剂盒(qiagen)回收并且通过nanodrop分光光度计(thermo fisher scientific)定量。50μg染色质(设定5μg染色质作为输入样品)用于一个测定。将pierce
tm
chip级蛋白a/g磁珠(thermo fisher scientific；每次测定25μl悬浮液)用冷封闭缓冲液(5mg/ml bsa，于pbs ph 7.4中)洗涤三次。将洗涤的珠与抗flag抗体一起孵育。
[0407]
集落形成测定
[0408]
将a549和h1299细胞接种在6孔组织培养板中(200个细胞/孔)并生长14天。将菌落用戊二醛(6.0％v/v)固定，用结晶紫(0.5％w/v)染色并拍照。
[0409]
细胞生长抑制测定
[0410]
将总共2000个细胞接种在96孔板中的100μl培养基中，用dmso或指定浓度的化合物处理3天。使用atplite 1step luminescence assay系统(perkinelmer)，根据制造商的说明书测量细胞活力。将存活细胞计算为相对于dmso处理的细胞的％。
[0411]
皮下肿瘤模型
[0412]
对于皮下注射模型，将4
×
106个h1299非小细胞肺癌细胞系细胞经皮下注射到5周龄babl/c裸鼠中。在h1299异种移植肿瘤植入一周后，根据体重将小鼠随机分成两组。对于药物治疗，通过腹膜内注射向两组小鼠每天施用含有dmso或200mg/kg ls-1-124的载体，持续26天。每两天记录一次小鼠体重和肿瘤大小。将肿瘤尺寸用卡尺测量并用下式估计：
[0413][0414]
动物实验均根据香港动物实验条例管制(control of hong kong animal experiment ordinance)和研究所关于动物工作的原则进行。动物实验的方案由香港大学教学与研究活体动物使用委员会(university of hong kong committee on the use of live animals in teaching and research，culatr)认可和批准，并在比较医学研究中心(centre for comparative medicine research，ccmr)指导和监督下进行。
[0415]
组织化学分析
[0416]
切割肿瘤组织并用4％甲醛浸渍固定过夜。然后用标准方案制备石蜡包埋切片。对于h&e染色，切片由香港大学病理学系(university of hong kong,department of pathology)染色。简而言之，石蜡切片用二甲苯和乙醇梯度去石蜡化并再水合。在去离子水洗涤后，将载玻片用苏木精和伊红染色，然后用乙醇梯度和二甲苯脱水。对于mki67，在石蜡切片脱蜡后，使用碱性磷酸酶抗原修复法执行免疫组织化学分析。mki67(abcam)抗体用于在4℃下以1:200稀释孵育过夜。在用tbst洗涤后，将切片载玻片与辣根过氧化物酶缀合的第二抗体(dako)一起孵育1小时。将样品用3,3
’‑
二氨基联苯胺(dab,sigma)显色，用苏木精染色，并且在盖玻片封固前用乙醇梯度和二甲苯脱水。另外，通过hamamatsu nanozoomer s210来扫描封固的载玻片。
[0417]
本文提及或引用的所有专利、专利申请、临时申请和出版物在它们与本说明书的明确的教导内容不矛盾的程度上全文以引用方式并入(包括所有附图和表格)。
[0418]
以下是示出实施本发明的程序的实施例。这些实施例不应解释为限制性的。除非另外指明，否则所有百分比均按重量计，并且所有溶剂混合物比例均按体积百分比计。
[0419]
实施例
[0420]
实施例1——yeats2 yeats抑制剂
[0421]
yeats2的yeats结构域被新近鉴定为组蛋白苯甲酰化读取者。yeats2 yeats优先地识别h3k27bz(kd＝21.57μm)，该h3k27bz结合亲和力高于h3k27cr(kd＝37.38μm)和h3k27ac(kd＝131.13μm)。基于十肽(h3
22-32
k27bz)，我们设计了光亲和探针h3k27bz-dzyne(图1a)，其中ala24被含有双吖丙啶(diazirine)的光反应性氨基酸(photo-leu)替换。探针还具有n-末端含炔烃的氨基酸(炔丙基甘氨酸)以与荧光标签生物正交缀合，用于可视化捕获的蛋白质。如果抑制剂可与探针占据相同的结合口袋，则荧光强度将降低(图1b)。
[0422]
如图1c所显示，photo-h3k27bz以浓度依赖性方式稳健地标记yeats2，并且在相同浓度下具有比photo-h3k27cr更高的标记效率。我们然后测试了衍生自组蛋白h3(残基22-32)的天然h3k27cr和h3k27bz竞争物对yeats2的抑制活性(图1d-1e)，它们分别显示196.3μm和100.4μm的ic
50
。
[0423]
为了鉴定具有较高效力的竞争物，我们通过三点竞争性光交联测定(图2b)测试了一系列衍生自具有携带不同含π体系官能团的lys27的组蛋白h3(残基)的肽(图2a)。从所有测试的π体系，苯并呋喃突显出比天然肽h3k27bz强得多的对yeats2的抑制效应，其中ic
50
为3.25μm(图2c)。
[0424]
我们接下来试图最优化具有较短长度和较高效力的抑制剂。在yeats2-h3k27cr复合体晶体结构中，kcr基团被y262和w282夹住，并且h3的基序“kcr27-s28-a29-p30-a31”主要有助于其结合。值得注意地，h3p30插入到yeats2的疏水口袋中以利于h3k27cr配位。因此，我们合成了四种小肽，其中从c末端逐个删除氨基酸，用疏水乙酰基封端肽的n末端(图3a)。与h3k27bf相比，ack
bf
sa(图3b-3c ic
50
＝32.1μm)和ack
bf
s(ic
50
＝58.8μm)显示出显著降低的抑制活性，而ack
bf
sapa(ic
50
＝7.4μm)和ack
bf
sap(ic
50
＝6μm)表现出对yeats2的类似效应，仅比h3k27
bf
降低2倍，这也揭示了n末端残基“tkaar”轻微地影响它们的相互作用。
[0425]
基于四肽“ack
bf
sap”，我们试图通过替换1-3位的氨基酸(图4a)并在n末端携带不同的保护基来最优化序列。通过三点竞争性光交联测定对75个未纯化的四肽进行筛选(图4b)。当p被其它天然氨基酸替换时，抑制活性显著降低，指示p在位置1处是保守的。对于位
置2和3处的优化，效力略有变化。值得注意地，具有甲磺酰基取代的4-12(ic
50
＝1.1μm)显著增强了抑制活性。
[0426]
接下来，合成并评价数十种苯并呋喃衍生物，6-溴-2-苯并呋喃和6-氯-2-苯并呋喃衍生物从热图中脱颖而出(图4d)。然后我们生成msk
bf
sap、msk
br-bf
sap和msk
cl-bf
sap(图5a-5i)，msk
br-bf
sap(ic
50
＝0.23μm)显示比msk
bf
sap(ic
50
＝0.61μm)增加2.7倍。msk
cl-bf
sap(ic
50
＝0.61μm)与msk
bf
sap相当。
[0427]
通过等温滴定量热法确定的解离常数(图6a-6h)显示了与它们针对yeats2 yeats结构域的相应效力一致的结果。两种天然肽h3k27cr(kd＝32μm)和h3k27bz(kd＝30μm)显示相似的结合亲和力。用苯并呋喃基团替换苯甲酰基(kd＝2.54μm)导致12.6倍结合增强，缩短为ack
bf
sap(kd＝1.2μm)也略微增加结合效力。在n末端用甲磺酰基(kd＝0.19μm)封端大大加强了相互作用，比天然肽h3k27cr结合增强168.4倍。苯并呋喃上取代的溴(kd＝0.089μm)和氯(kd＝0.093μm)对yeats2 yeats结构域产生更高的结合亲和力。
[0428]
在体外活性的支持下，我们接下来将msk
br-bf
sap应用于活细胞。执行细胞热移位测定，以测试抑制剂是否可靶向内源性yeats2蛋白。将用或不用20μm msk
br-bf
sap处理的h1299细胞在不同温度下加热，然后提取可溶部分并通过western印迹分析。如图7a中所显示，msk
br-bf
sap明显提高了yeats2在几种温度(如46.5℃和47℃)下的稳定性。
[0429]
为了评价抑制剂破坏yeats2的染色质缔合的能力，执行光漂白后荧光恢复(frap)测定。3-yeats2 yeats结构域与在u2os细胞中过表达的gfp蛋白融合。与dmso处理的样品相比，20μm msk
br-bf
sap处理的样品允许光漂白后恢复时间显著增加，表明3-yeats2-yeats-gfp的迁移率通过用我们的抑制剂替换乙酰化染色质而升高(图7b和7c)。
[0430]
为了探究抑制剂对基因调控的效应，我们在h1299(稳定表达3
×
flag-yeats2蛋白)中进行染色质免疫沉淀和定量pcr(chip-qpcr)。已知yeats2在单独核糖体基因(rp7、rpl8、rpl35和rpl38)上富集。在msk
br-bf
sap处理后基因丰度下降，指示抑制剂可阻断靶基因上的yeats2依赖性富集(图7d)。
[0431]
癌细胞通常由于无限分裂而失去生长控制。我们接下来试图测试我们的抑制剂是否能够抑制nsclc细胞的增殖。在a549细胞的克隆生成测定中(图8a)，化合物msk
br-bf
sap和msk
cl-bf
sap孵育细胞14天，然后用戊二醛固定集落并用结晶紫染色。根据结果(图8b)，与对照细胞相比，经处理的细胞形成更少的集落。
[0432]
基于肽的抑制剂通常具有低细胞渗透性。比较msk
bf
sap与msk
bf
fap，它们显示相似的抑制活性，但对于logp有巨大差异。s转化为f衍生物可有助于更好的细胞渗透性而不丧失效力。估计14种类似物(表1)，几种化合物(hc-3、hc-4、hc-8和hc-14)表现出相当的效力和理想logp值。
[0433]
表1.hc-1至hc-14的结构和对yeats2 yeats的抑制活性.
[0434][0435]
可通过减少抑制剂的氢键供体来增加细胞渗透性。如图9a-9g和图11a-11b所显示，检测了涉及n-甲基ala(hc18)和n-甲基ser(hc19)的抑制剂，hc18保持了抑制活性。在msk
bf
sap的c末端删除酰胺键显示对相互作用没有影响，此外，更大的环取代的抑制剂(hc15b：ic
50
＝0.13μm)可通过在yeay2蛋白的疏水口袋中占据更多空间来增强效力。总之，随后合成hc24b、hc25b和hc26b以分别得到对yeats2 yeats结构域0.58μm、0.65μm和0.52μm的ic
50
。
[0436]
为了评估抑制剂的细胞渗透性行为，在h1299和a549细胞中分析细胞效应。我们用不同浓度的抑制剂处理细胞3天。使用atplite 1step luminescence assay系统(perkinelmer)，根据制造商的说明书测量细胞活力。将存活细胞计算为相对于dmso处理的细胞的％。如图10a-10b所显示，与原始化合物(msk
br-bf
sap和msk
cl-bf
sap)相比，hc24b和hc26b均以50μm在h1299和a549细胞中展示出有效的抑制，揭示我们的策略可以成功地改善细胞渗透性。更重要地，化合物hc24b、hc25b和hc26b在集落形成测定中对细胞增殖表现出更强的抑制(图10c)。
[0437]
在体外活性的支持下，我们接下来试图最优化肽衍生的抑制剂的类药特性。策略被应用成通过减少氢供体基团来改善亲和力和细胞渗透性。如图11a所显示，检查了涉及n-甲基ala(hc18)和n-甲基ser(hc19)的抑制剂以显示hc18保持抑制活性，而丝氨酸位点处的n-甲基化显著降低效力。在msk
bf
sap的c末端缺失酰胺键显示对相互作用没有影响。值得注意地，较大的环取代的抑制剂(hc15b：ic
50
＝0.13μm)进一步通过在yeay2蛋白的疏水口袋中占据更多空间来增强效力(图11b)。
[0438]
lipinski五规则显示clogp是估计化合物的渗透性和吸收的最关键因素之一。通过分析序列最优化结果，我们发现msk
bf
sap(ic
50
＝0.6μm，clogp＝-0.64)与msk
bf
fap(ic
50
＝1.4μm，clogp＝1.6)具有相似的亲和力，但clogp值完全不同。我们接下来合成了几种f衍生物(图12a)并通过发光atp检测试剂盒评价那些化合物的细胞活力。接着，使用集落形成测定，使细胞活性化合物经受测定细胞增殖。如图12b所显示，ls-1-124显著抑制nsclc细胞生长。
[0439]
为了评估抑制剂破坏yeats2的染色质缔合的能力，执行光漂白后荧光恢复(frap)测定。串联-融合有gfp蛋白的yeats2 yeats结构域在u2os细胞中过表达。ls-1-124的处理
显著减少了光漂白后的恢复时间，这表型模拟了kbz结合缺失的yeats2突变体(w282a)，表明通过用我们的抑制剂替换乙酰化染色质而使串联-yeats2-yeats-gfp迁移率增加(图13a)。当通过过表达af9-gfp、enl-gfp和gas41-gfp将ls-1-124应用于frap测定时(图13b)，在回收率中并未观察到差异，指示在细胞环境中，ls-1-124在yeats家族中的yeats2选择性。
[0440]
为了检测ls-1-124与内源yeats2的接合，将h1299的全细胞裂解物与探针1光交联(图14a)，然后将标记的蛋白质与生物素-n3缀合并用链霉亲和素富集。通过免疫印迹分析洗脱的蛋白质混合物。在没有抑制剂的情况下，标记率超过1％，并且超过90％的内源性yeats2在5μm的ls-1-124存在下被阻断(图14b)。
[0441]
为了进一步证明yeats2抑制可用于治疗nsclc，我们在小鼠异种移植模型中测试了ls-1-124，其中将h1299细胞经皮下注射到免疫缺陷小鼠中。一周后，将小鼠随机分成两组并通过每天腹膜内(ip)注射对照载体溶剂(dmso，n＝6)或ls-1-124(200mg/kg，n＝5)进行处理。在处理26天后收集肿瘤并监测。与对照相比，ls-1-124处理显著抑制肿瘤生长(图15a)。ls-1-124在小鼠中没有引起明显的毒性，并且在ls-1-124处理的小鼠中没有观察到显著的体重减轻(图15b)。在用抑制剂处理后，肿瘤体积和重量均减少(图15c)。在用ls-1-124处理后，通过h&e染色检测坏死(图15d)。执行ki67的免疫组织化学染色以评估ls-1-124对体内肿瘤细胞增殖的效应。如图15d所显示，与载体处理相比，在ls-1-124处理中观察到显著降低。总之，这些数据表明用ls-1-124抑制yeats2降低了体内肿瘤生长。
[0442]
应当理解，本文所述的实例和实施方案仅用于说明目的，并且将向本领域的技术人员提出根据其作出各种修改或更改，并且包括在本技术的精神和范围之内。此外，本文所公开的任何本发明或其实施方案的任何要素或限制可以与本文所公开的任何和/或所有其他要素或限制(单独地或以任何组合)或任何其他本发明或其实施方案组合，并且所有这样的组合设想在本发明的范围内而不限于此。